[发明专利]一种检测血清DNA的方法

说明书

本发明属血清学检测技术领域，具体涉及一种恶性肿瘤患者血清DNA的检测技术。

近年来细胞生物学及分子生物学发展迅猛，研究发现人体癌细胞在体内可长期存在、生长及广泛转移，以至于最终导致宿主无法耐受癌细胞对组织或器官的破坏而衰竭死亡。然而，癌细胞在机体内并非无限止分裂、生长及繁殖，实际上癌细胞在生长过程中会出现自发性死亡(坏死或凋亡)。因此，癌症患者体内也会随着癌细胞的死亡及破裂而导致胞内物质外溢，其中核内物质也相应地进入体液，以至血清中DNA含量也相应增加。但因细胞在死亡时胞内核酸酶也会切割大分子DNA，故血清中将不再可能以大分子形式存在，而是被小分子DNA所取代。虽然血清中癌细胞DNA分子量较小，但其仍能维持及表达癌细胞耒源的分子遗传特性。

更有意义的是癌症患者经用化学药物或放射治疗后可使大量癌细胞破坏或杀死，同样可导致血清中癌细胞来源的DNA含量增高。从而通过连续测定血清中的DNA分子遗传特性，在一定程度上可明确反映放化疗对癌细胞的杀伤功效。

本发明的目的是提供一种简易、灵敏、特异性强的检测肿瘤患者血清DNA的方法，为肿瘤患者血清学诊断和治疗前后的连续检测、预后，提供实验检测依据。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

(1)癌患者血清DNA纯化：

抽取肿瘤患者新鲜5毫升左右全血，搁置于室温约30分钟后离心2,000转20分钟，分离血清及凝血块，进一步将血清继续作高速离心以防止任何血细胞的污染。血清与等体积Tris缓冲液混匀并加入蛋白酶(PK)后放于摄氏37度水浴箱内18小时，再进一步通过DNA柱层折而获洗脱液，加入冷冻无水乙醇及1/10倍体积3.0M醋酸钠并搁置于低温冰箱过夜，高速离心而获沉淀并用预冷75％乙醇洗二次，继续用RNA酶处理而获纯化血清DNA。该DNA经0.8％Agarose凝胶电泳并与标准DNA分子量比较，而确定血清分子量来证实所纯化的血清DNA的可靠性。结果表明从血清中所纯化的DNA分子量约为2000bp左右。

(2)血清DNA检测：

采用纯化的血清DNA 100-500毫微克之间进行检测一些与恶性肿瘤相关的基因如癌基因、抑癌基因及染色体丢失，根据检测结果确立癌细胞在体内的存在状态及其DNA的遗传特征，为恶性肿瘤临床诊断提供实验依据。

经采用本发明方法可快速、简易、特异性地获得纯化血清DNA。在此基础上，对100余例癌症患者血清DNA进行微卫星不稳定(3p14、3p25)、抑癌基因(p15)及C-myc、C-erbB2、EGFR癌基因扩增检测并与相对应的同一患者外周血淋巴细胞及癌组织DNA进行比较研究，结果表明血清中DNA与癌组织DNA的分子变异相一致，而与正常血细胞有明显差异。结果显示人癌症患者外周血中血清DNA能反映体内癌细胞的分子遗传特性，从而为开创血清分子生物学诊断提供了有价值的技术。”

实施例1：

对50例不同分期的肺癌及50例卵巢癌患者及相应的非癌患者纯化血清DNA作多种癌基因的扩增检测，结果表明非癌患者未出现癌基因扩增，而癌患者的基因扩增阳性率与癌患者的恶性程度相关并与癌组织DNA的结果相吻合。经三种癌基因C-myc、C-erbB2及EGFR在50例非小细胞肺癌血清DNA中作C-myc、C-erbB2及EGFR三种癌基因的多基因共扩增检测，结果提示晚期肺癌患者(IIIa期)共扩增率达55％，而早期患者仅为16％(P＜0.005)。同样在50例卵巢癌患者中也观察到上述类似情况，癌基因共扩增率在晚期卵巢癌患者中明显高出早期患者一倍以上。

实施例2：

对50例卵巢癌患者作p15基因纯合性丢失检测，结果表明血清DNA p15基因纯合性丢失率达45％略高于癌组织DNA丢失率40％，而相应外周血细胞DNA中却未见丢失。3p14、3p25位点处杂合性丢失检测，结果表明血清DNA抑癌基因丢失的检测结果与癌组织来源的DNA完全一致。

附图说明图1为人体癌症患者外周全血DNA分子量图，其中包括血细胞及血清中所纯化的DNA。图中血球DNA分子量大于2.3万kb以上，而血清DNA分子量仅为2000kb。