[发明专利]一种新的多肽——人DNA连接酶9和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽--人DNA连接酶9，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

DNA的复制是一个极为复杂的过程，有很多酶和蛋白质的参与。人们把这些酶和蛋白构成的复杂系统称为“复制体”。“复制体”的功能包括：亲代双螺旋DNA的解链，暂时稳定DNA的单链状态，子链合成的起始、延伸和终止，复制过程中能量的提供，催化碱基的校正等等。复制体是复制叉上DNA模板以特定的结构与酶和蛋白质偶联成的核蛋白复合物，它的组份是逐步装配到DNA上的，处于不同的复制阶段的复制体的组成也不同，目前已发现参与DNA复制过程的酶和蛋白质有30多种。

DNA连接酶是一种封闭DNA缺口的酶。它需要DNA模板，与模板配对的互补单链上具有5’-P和3’-OH末端的缺口，不缺少任何核苷酸时，DNA就可以由ATP提供能量，把断裂的磷酸二酯键在5’-P和3’-OH之间重新连接起来。

DNA连接酶作用的三个步骤是：

(1)酶的活化，这是需能反应，ATP或NAD与酶结合形成E-AMP中间物，其中AMP转移到E的Lys-NH₂基团上，生成E-Lys-AMP和PPi。

(2)E-AMP中间物内AMP转移到DNA的5’-P上，使之活化，生成5’-P-P-A和E。

(3)活化的5’-P与缺口内3’-OH基作用，形成5’-P-3’磷酸二酯键，释放AMP。

真核生物、细菌、病毒和噬菌体的DNA连接酶是依赖于ATP的，DNA连接酶中有一个保守的赖氨酸残基，它在上述的DNA连接酶作用过程的第一步中是腺苷酰作用的位点。(Tomkinson A.E.,Totty N.F.,Ginsburg M.,Lindahl T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:400-404(1991))；(Lindahl T.,Barnes D.E.Annu.Rev.Biochem.61:251-281(1992))

在几乎所有生物的DNA连接酶氨基酸序列中，都包含有以下的两段保守的序列：(1)[EDQH]-x-K-x-[DN]-G-x-R-[GACIVM]，其中，K代表的是有活性的氨基酸残基；(2)E-G-[LIVMA]-[LIVM](2)-[KR]-x(5,8)-[YW]-[QNEK]-x(2,6)-[KRH]-x(3,5)-K-[LIVMFY]-K，人的DNA连接酶具体的结构请参阅相关文献。(Kletzin A.Nucleic Acids Res.20:5389-5396(1992))

人DNA连接酶在DNA复制、DNA的修复和DNA的重组等过程中均发挥着重要的作用，特别是对于DNA的复制中子链的合成有着重要的意义，因此，人DNA连接酶间接的影响着人体的细胞分裂等重要的过程。

通过基因芯片的分析发现，在胸腺、睾丸、肌肉、脾脏、肺、皮肤、甲状腺、肝、PMA+的Ecv304细胞株、PMA-的Ecv304细胞株、未饥饿的L02细胞株、砷刺激1小时的L02细胞株、砷刺激6小时的L02细胞株前列腺、心、肺癌、胎膀胱、胎小肠、胎大肠、胎胸腺、胎肌、胎肝、胎肾、胎脾、胎脑、胎肺以及胎心中，本发明的多肽的表达谱与人DNA连接酶10的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为人DNA连接酶9。

由于如上所述人DNA连接酶9蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的人DNA连接酶9蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新人DNA连接酶9蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾1病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。

本发明的一个目的是提供分离的新的多肽--人DNA连接酶9以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码人DNA连接酶9的多核苷酸的重组载体。

本发明的另一个目的是提供含有编码人DNA连接酶9的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供生产人DNA连接酶9的方法。

本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽--人DNA连接酶9的抗体。

本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽--人DNA连接酶9的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。