[发明专利]重建人t－PA分子及表达重建人t－PA蛋白的工程菌株

权利要求书

1．一种重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr，其基因全序列为：CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA                                →tPA 编码             pst IACG CAG ATG ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGAAGC AAC CGG GTG GAA GAT TGG TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CACTCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACCTGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGATTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG GGT ACC TGC GGC                                                 Kpn ⅠCTG AGA CAG GAC ACC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCCGAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGGTCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGV GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TCC TGGATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTTACG GTG ATC TTG GTC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAGCAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GAC                                                            EcoR ⅠACT TAC GAC AAT TAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGCTGT GCC CAG GAG AGC CGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GACCTG CAG CTT CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CATGAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGACTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTCACC GAC AAC ATG GTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCAAAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTGAAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CGG GGC TGTGGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GACTGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA                                                  stop 。

2．一种用于表达权利要求1所述的重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr的工程菌株E．coli JMl09pQEtPAr，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M200018。

3．权利要求1所述的重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr的重建方法，其特征在于：

以脐带血管内皮细胞总RNA为模板，设计了4条核苷酸引物：(1) 5’ -GAG CTC ATG AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA-3’                       BglⅡ(2)  5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’                  KpnⅠ(3)  5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’                  KpnⅠ(4)  5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’                      HindⅢ其中引物(1)和(2)为一组，引物(3)和(4)为一组，用RT-PCR法分别扩增模板获得t-PAN端包括F-G区编码和C端P区编码的一个约0．3Kb DNA片段和一个约0．8Kb DNA片段，再分别克隆到puc-T载体中，转化DH5α菌株，鉴定后扩增质粒，用内切酶切割、低熔点琼脂糖电脉回收0．3和0．8Kbr DNA带，把编码N端氨基酸的0．3Kb DNA定向克隆到原核表达载体pQE30的BamH I-KpnⅠ位点，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之间，建成pQEtPA2，扩增pQEtPAl质粒DNA，用Kpn I和HindⅢ切割，定向插入0．8Kb的C端P编码区，建成pQEtPAr，即为本发明重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr分子。