[发明专利]快速检测β2－兴奋剂的方法

说明书

本发明涉及药物残留检测的方法，尤其是关于一种快速检测β₂-兴奋剂的方法。

β₂-肾上腺素能兴奋剂(简称β₂-兴奋剂)中有一类人工合成激素类药物，如克伦特罗(Clenbuterol)，Salbutamol等，临床上用于治疗哮喘和支气管痉挛等疾病，但如提高剂量5-10倍，并长期使用，还有增强肌肉，减少脂肪的副作用，这一特点使它常被用作为生长促进剂而添加饲料中，提高家畜的瘦肉率(这些药物俗称瘦肉精)(Biancotto Getal J.MassSpectrum.34(1999)1346)。这些药物的滥用对消费者健康造成危害。欧盟96年已禁止β-兴奋剂作为生长促进剂(E.C Directive 96/22/EC of29/4/1996，Official Journal of the European Communities，No L125/3，23.5.96.)，我国也已制定法规，上海市政府已承诺让市民吃到“放心肉”。但利益驱使，兴奋剂在养猪业中已成为泛滥之势。上海等8省市饲料、养殖等有关行业中违禁品检出率高达19.8％(人民日报2000年6月9日出版)。因此迫切需要建立准确、快速的检测方法。

国内外现有检测方法较多，较成熟的方法主要有二类：一类为仪器分析类(Biancotto G，et al.，Mass Spectrum.34(1999)：1346.)，准确灵敏，但操作烦琐，时间长，耗费人力和物力，成本高，不适于筛选工作；第二类为免疫分析类，存在假阳性结果的可能，需仪器法确证。以上二类方法需使用精密仪器，只能实验室操作，无法在现场测试(蔡纯等，现代商检科技，8(1998)：52)。有报道采用免疫纸片快速检测法(VanoosthuyzeK.E.I.et al，J，Agric.Food.Chem.45(1997)：3129；Ploum M.E，et al.J，Chromatography 564(1991)：413.)，但由于其抗原-抗体结合的免疫学原理仍存在一些固有的弱点，如抗原-抗体亲和力不高；仍存在假阳性的可能；一种抗体只能检测一种或具有共同抗原决定簇的几种药物，无法检出所有β₂-兴奋剂等。

本发明的目的是提供一种基于受体-配基结合原理的快速检测β₂-兴奋剂方法。在灵敏度、特异性、耗时等指标上优于现有免疫分析法，适用于现场快速检测，并适用于所有β₂-兴奋剂的检测。

本发明提供一种快速检测β₂-兴奋剂的方法，它是基于受体-配基结合原理，应用细胞化学方法，将β₂-受体或含有该受体的细胞固定于固相基质，加入测试样品及酶标记的β₂-兴奋剂作竞争抑制试验，加底物显色后确定样品中β₂-兴奋剂的有无或作定量计算。本发明方法中采用的材料

(1)固相基质

可分为二类，一类为塑料基质的微孔板，如细胞培养板、酶标板等；另一类为各种滤膜，如尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等，这些基质都能结合大分子的蛋白质或细胞。

(2)β₂-受体或含有该受体的细胞

β₂-受体是一种细胞膜蛋白，可以是重组或天然提取，生理条件下，它与β₂-兴奋剂结合后，通过偶联的G蛋白激活腺苷酸环化酶，由此导致的第二信使cAMP含量增高，引发细胞一系列生理效应。应用分离纯化的β₂-受体固定于固相基质上，虽已不能引发生理效应，但仍能结合相应配基。

β₂-受体分布于多种类型的细胞(如淋巴细胞、肌肉细胞等)的表面。采用适当的固定技术，这些细胞表面的β₂-受体仍具有对β₂-兴奋剂的结合能力，其功能与上述β₂-受体类同。

(3)酶标配基

采用化学交联方法将酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)与配体β₂-兴奋剂(如Clenbuterol或Salbutamol)交联，制得酶标配基，与样品中的β₂-兴奋剂竞争结合β₂-受体结合位点，与底物反应后根据显色强弱可判断结果。

本发明方法用于检测β₂-兴奋剂的具体步骤包括：

(1)酶标配基的制备