[发明专利]外周血中肝细胞的检测方法

说明书

本发明涉及到有关临床肝癌诊断中采用的检测方法，尤其是关于外周血中肝细胞的检测新方法。

肝癌是遍及全球的死亡率高的癌症之一。尽管目前对肝癌相关的一些病理学因素有了较好的认识，但引起肝癌的分子机理仍不清楚。肝胆切除术仅是肝癌形成期的有效治疗，而不适合于肝外转移的肝癌患者。外周恶性细胞的检测对证明癌微小的转移、设计治疗策略、估价治疗效果和预见外科手术后复发的可能性很有帮助(AkriviadisEA.et al.，Br J Surg 1998；1319-1331)。

α-白蛋白(ALF)与肝癌的一种广泛应用的诊断指标α-甲胎蛋白(AFP)具有高度同源性，但它与肝癌的关系仍没有报道。白蛋白基因家族由四个基因编码的白蛋白、ALF、AFP和维生素D粘合蛋白组成，它们连续排列在4号染色体短臂亚着丝粒位点(Lichenstein HS.et al.，J Biol Chem1994；269：18149-18154.；Nishio H.Et al.，J Mol Biol 1996；259：113-119)。在这些蛋白基因中，AFP选择性地在胎儿的肝中表达，而ALF和维生素D粘合蛋白的表达限制于新生儿和成人的肝中。然而，在60-70％的肝癌细胞中AFP表达出现再活化，且刺激肝癌细胞生长是AFP的生物学功能之一。由于AFP基因的异常表达是肝癌患者的主要特征之一，所以血清AFP被作为肝癌的一种诊断指标。从肝癌原发灶释放的外周血肝癌细胞通常用来检测肝癌患者不同时期的肝外转移。尽管外周血中，AFP信使RNA(mRNA)表达通常作为血源性脱落的肝癌细胞的一种指标，但在肝硬化患者检测中AFP mRNA表达的假阳性结果占相对高的百分比(达30％)(Funaki NO.Et al.，Life Sci 1998；62：1973-1984.；Matsumura M.et al.，hepatology 1994；20：1418-1425)。

AFP被广泛地研究，但ALF和肝癌的关系已知的很少。AFP mRNA表达作为血源性脱落的肝细胞的一种指标检测灵敏度不高，而白蛋白mRNA在正常人外周血中也表达，因而没有特异性(Muller C.Hepatology1997；25(4)：896-9.)。因此，研究ALF mRNA表达与肝脏疾病之间的关系是一个新的课题。

为此，本发明的目的是提供一种外周血中肝细胞检测的新方法，作为检测肝癌的一个辅助手段。通过检测外周血中肝细胞ALF mRNA表达和AFPmRNA表达，区别正常肝细胞和恶性肝细胞，从而为临床诊断肝脏疾病提供更可靠、有力的证据，降低肝硬化所造成的假阳性结果，以利于临床诊断治疗肝癌。

本发明一种外周血中肝细胞检测的新方法是采用外周血取样、巢式PCR技术，检测外周血中肝细胞ALF mRNA表达，结合检测外周血中肝细胞AFPmRNA表达，从而提供一种外周血中肝细胞检测的新指标，它包括以下步骤：

1.外周血取样，RNA提取及反转录成cDNA

从肝癌患者取外周血样品，肝素化。对照的外周血样品从正常人身上获得。血样立即用于RNA提取。然后进行反转录，加入RNA，随机引物，核糖核酸酶抑制剂，dNTPs，反转录缓冲液及反转录酶，使mRNA反转录成cDNA。

2.外周血肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增

外周血肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增按下列两引物进行，ALF的PCR引物用GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，用TGAAACTACTAAAACTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作内引物。AFP的PCR引物用CTGCAAACTGACCACGCTG和TGCTTGGCTCTCCTGGATG作外引物，用GGTCAATGTATAATTCATGCAG和ATTTCTGTAATTCTTCTTCTCC作内引物。

3、PCR产物分别于2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析

由统计结果可以看出，正常人外周血中ALF mRNA和AFP mRNA都不表达；肝癌患者AFP mRNA检出率为93％，ALF mRNA检出率为10％。因而可以把外周血中ALF mRNA表达作为检测肝癌的一个辅助指标。即外周血中ALF mRNA和AFP mRNA的阴性结果作为良性肝细胞的指标，AFPmRNA的阳性结果而ALF mRNA的阴性结果作为恶性肝细胞的指标。