[发明专利]由深红酵母菌培养产生L－苯丙氨酸解氨酶的培养条件

说明书

本发明涉及酶法生产L-苯丙氨酸(L-Phe)发酵工艺中酶的培养，确切地说是由深红酵母菌(Rhodosporidium Rubra)培养产生L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)的培养条件。

L-苯丙氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，是多种抗癌药物的重要原料和中间体，也是低热值甜味剂阿斯巴甜的主要原料之一，市场前景极为广阔。虽然L-苯丙氨酸的合成方法很多，但是自从用来自微生物的天门冬氨酸酶由富马酸和氨高效地合成天门冬氨酸获得成功之后，便有力地推动了由肉桂酸经酶转化为L-苯丙氨酸的研究和开发。酶法合成L-Phe的反应式如下：

PAL在上述反应中极为关键，其来源和活性的高低无疑是十分重要的。

PAL广泛存在于多种植物和微生物的细胞中，有工业应用前景的主要是来自微生物细胞，除酵母菌属外，许多霉菌和放线菌等20多种菌属都具有产生PAL的能力。早期国外报导的多由地丝菌属、从梗孢属、共头霉属、曲霉属等菌株产生的PAL用于肉桂酸的转化，最近大量报导的是使用酵母菌属的菌株，其产酶培养基中均含有1.0％酵母膏、1.0％蛋白胨和0.05％KH₂PO₄，其他如L-Phe、葡萄糖、(NH₄)₂SO₄、PH等作为可变的因素予以取、舍。国内报导的使用酵母菌属其酶培养基亦基本相同(《微生物通报》1989,16,328-331；《微生物学报》，1994,34(2),137-142)。

由粘红酵母菌(Rhoclotorula glutinis)诱导产生PAL的培养条件有的以山梨醇为碳源和添加L-Phe的培养基中培养，并添加0.5％L-异亮氨酸以防止酶活性的降低。转化时肉桂酸的浓度应低于60mM,PH10,7.5M氨条件下可得到L-Phe 16.5g/L，转化率70％(《化学进展》1996年3月，Vol.8.No.1 P.52)。有的培养基为葡萄糖0.5％、玉米浆4％、豆饼粉1.5％、NaCL0.5％、L-Tyr0.1％、K₂HPO₄0.1％、泡敌0.01％、PH5.5。转化后最终产生L-Phe33g/L(《氨基酸和生物资源》，2000,22(1),5-7)。

中科院上海生化所储瑞蔼等研究了用2.5％卡拉胶固定化的深红酵母菌用于肉桂酸的转化，其培养基为葡萄糖0.5％、胰蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％、KH₂PO₄0.05％、L-Phe0.05％、PH7,30℃发酵15～17h。最佳转化条件为1.0％反式肉桂酸，4mol/L铵离子，PH10.5，转化率达77.7％(《生物工程学报》，1997,13(1),70～75)。

本发明亦以肉桂酸为底物，采用深红酵母菌诱导产生的PAL进行转化，通过改变培养条件，旨在增强PAL的活性，提高底物的转化率和最终产品L-Phe的浓度。

本发明对深红酵母菌的培养亦经过菌种活化、摇瓶培养和发酵三个单元过程。然后将发酵液离心分离后得到的菌泥加入由肉桂酸、氨和铵盐构成的转化液中进行转化。具体工艺如下：

1、菌种的活化

菌种斜面培养基配比：麦芽汁：8～10Be°，琼脂：1.5～2.0％

接种斜面，32℃培养15～20h，使生长丰满。

2、摇瓶种子培养

种子液配比：L-tyr 0.1～0.5％     玉米浆 1～2.5％(V/V)

            KH₂PO₄ 0.1～0.5％  PH 5.0～5.5

            消泡剂 0.01％        余为蒸馏水。

配种子液200ml于1000ml三角瓶中，121℃灭菌20mins，接种后于摇床震荡培养15～20h，摇床转速为80～110r/min，培养温度为30～34℃。

3、空消种子罐121℃,30mins，配发酵液，配方同种子液，实消121℃,20mins，接种种子液于发酵罐，接种量0.5～2.0％(V/V)，培养温度为30～34℃，通风量为1.5～2m³/h，最佳为1.8m³/h，培养25～30h，最终PH为8.5。

4、转化