[发明专利]日本血吸虫虫卵抗原模拟肽、筛选及其用途

说明书

本发明涉及一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽，即一种利用噬菌体表面展示技术筛选的，能模拟日本血吸虫虫卵抗原的噬菌体多肽，还涉及该日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法以及其在血吸虫病诊断中的应用，属生物技术领域。

血吸虫广泛分布于世界各地，尤其是发展中国家。有五种血吸虫可以感染人体并引起人体的血吸虫病。在我国以日本血吸虫为主，日本血吸虫的虫卵产量比其他虫种都高，即使在产卵量相同的情况下，其虫卵的致病作用也比其他虫种的大，虫卵的沉积可引起血管的堵塞、组织坏死、肉芽肿反应和组织纤维化。因此虫卵在日本血吸虫对人体的致病过程中有着重要的作用。对于血吸虫病的研究，发展理想的诊断试剂和疫苗是两个主要方面。最初，血吸虫病的诊断方法以常规粪检为主的病原学检查，这种方法因工作量大、漏检率高，不能满足疫情检测的需要；目前虫卵抗原用于临床检测是诊断血吸虫病的主要方法之一。DunneD,Hillyer GV,Vazquez G等在《美国热带医学与卫生杂志》(Am J TropMed Hyg 1988;38：508)中记载：将可溶性虫卵抗原(Soluble Egg Antigen,SEA)用阳离子交换色谱法分离纯化得到纯化片段虫卵(Cation ExchangeFraction,CEF6)分子抗原，而虫卵CEF6分子抗原是导致环卵沉淀现象产生的重要成分之一，目前主要用于曼氏血吸虫病的诊断。但是，目前虫卵抗原主要是用实验动物来制备的，这样要耗费大量的动物，因此制备成本高，且制备方法较为烦琐。本发明正是利用免疫诊断方法，利用噬菌体表面展示技术筛选出的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽，检测血吸虫病人的血清，以达到诊断的效果。

本发明的目的在于提供一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽。

本发明的另一目的在于提供一种简单易行、成本低的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法。

本发明的另一目的在于提供该日本血吸虫虫卵抗原模拟肽在血吸虫病诊断中的应用。

本发明所述的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽具有如下外源多肽系列：NH₂-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH。

本发明所述的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽由噬菌体表面展示技术筛选而得，即在噬菌体表面表达外源抗原表位或外源肽，并制成库，而随机肽噬菌体表面展示技术则所是表达的外源肽是具一定长度且随机合成的。然后通过特异性结合物(如单抗)的亲和富集、筛选与之相结合的噬菌体，这样就得到了相对应的抗原表位或肽，并在大肠杆菌中可大量增殖，因此一个重组噬菌体所展示的特异性表位只要被鉴定，那么此噬菌体就可以成为特异性抗原的无限来源。

利用噬菌体表面展示技术筛选日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的过程如下：

将由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供日本血吸虫虫卵抗原的单克隆抗体6B12，6B12为实验室编号，固定在聚苯乙烯酶标板上，加入由美国密苏里大学的GP.Smith教授赠送的噬菌体随机15-肽文库，其多样性为10⁸，从15-肽噬菌体文库中筛选与6B12有特异性结合力的噬菌体，洗涤以去除非特异性结合的噬菌体，然后用pH值为2.5的洗脱液将结合在单抗6B12上的噬菌体洗脱下来，中和后感染美国密苏里大学的GP.Smith教授赠送的大肠杆菌K91Kan，扩增后将噬菌体的提取纯化，即为第一轮的富集噬菌体，将其作为第二轮筛选的起始物，用提高亲和力的筛选方法，经过三轮筛选后，得到与6B12结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽，再将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，并结合ELISA、竞争ELISA和Western-blot方法挑选出与6B12有强阳性反应的噬菌体克隆，然后进行鉴定，证明与单抗6B12结合的位点是噬菌体的PⅢ蛋白质所携带外源多肽。

通过上述操作，从400个单克隆化的噬菌体中挑选出43个与单抗6B12有高亲和力的噬菌体，再从43个噬菌体中挑选出13个与6B12的决定簇有特异性反应的目标噬菌体，对这13个目标噬菌体所插入的外源多肤进行编码DNA序列分析后，发现这13个目标噬菌体所携带的编码DNA序列完全相同，都是：5’-AAT-GTT-TCT-CGT-TGT-TCT-TGC-GCT-ATG-CCT-TGG-CTT-TGG-GTG-GTT’3，其相应的外源多肽序列为：NH₂-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH，从氨基酸组成来看，该肽段偏碱性，具有很强的亲水性。