[发明专利]抗人龋齿致病菌蛋白基因及其制备方法

说明书

本发明涉及突变或遗传工程。

龋齿被人们认为是人类最普遍的感染性疾病。关于免疫防龋的研究已有近30年的历史。早在60年代末期，国外学者即开始了对防龋疫苗的探索，期望通过接种防龋疫苗，能有效阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定殖，达到预防龋齿的目的。近年来，运用免疫学手段控制龋齿病更为其研究的热点，主要有以下几个方面：

一、主动免疫防龋

主动免疫是用人工接种的方法给机体输入抗原性物质，刺激机体免疫系统产生免疫应答，从而提高机体抗病能力。在主动免疫防龋研究过程中，存在着一些障碍，主要包括三个方面：(1)变形链球茵(简称变链菌)等致龋茵一般定殖在宿主组织表面，而在这些部位是难以激发有效的免疫反应的；(2)抗变链菌抗体能与机体组织蛋白特别是心脏组织发生交叉反应，产生免疫复合物介导的疾病，如细菌性心内膜炎；(3)变链菌与口腔内其它链球茵具有交叉反应性抗原，防龋疫苗介导的免疫反应可能破坏口腔内正常菌群的生态平衡，因此多年来学者们一直致力于通过改变免疫原、免疫途径、免疫佐剂和免疫频率等手段，企求寻找一种安全有效的防龋疫苗。

1．全面疫苗：早期的防龋疫苗研究，主要是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。这一时期的研究充分表明，利用变链菌全细胞多价疫苗的确可防止龋病的发生，但进一步研究却显示，与其它链球菌相似，变链菌某些抗龋成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体。

2．抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防齿转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要蛋白抗原(PAc或AGⅠ/Ⅱ、PⅠ、SpaA等)和葡糖基转移酶(GTase)，它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要的作用。近10年的大量研究证实，用PAc和GTase主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，但纯化的抗原不会介导心脏交叉反应，学者们尝试了经口服鼻内注射、皮下注射和腹腔注射等多种途径加以佐剂进行免疫，纯抗亚单位疫苗的一个很大不足在于很难获得足够量的这些纯抗原。

3．多肽疫苗：自90年代以来，随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，从分子水平对变链菌PAc和GTase的认识逐步深入，目前，碥码这两种抗原的Pac和gtf已被克隆，核甘酸序列已基本清楚。用PAc和GTase分子中与某特定功能相关并具有免疫原性的核酸序列制备多肽防龋疫苗，已成为免疫防龋研究的热门。目前研究证实，PAc分子N末端唾液结合区(SBR)，粘附功能区(8516-1213位残基)、A区T细胞和B细胞抗原决定簇等；GTase分子的氨基末端的酶促区(CAT)、羧基末端的葡聚糖结合区(GLU)和高度保守的酶活性片段(GGY和AND)等是理想的候选多肽。

由于多肽疫苗仅为病原体的单一保护性抗原或某一抗原决定簇，单纯以游离的多肽免疫动物，常不能产生理想的免疫效果，还需将其结合至大分子载体上以增强其免疫原性。将PAc和SBR与CT-B嵌合并以CT为佐剂，经鼻内免疫大鼠、可激发高水平的唾液抗PAc IGA抗体，并导致实验动物龋活性下降。以SBR与CTA/B嵌合口服免疫小鼠，也能激发高水平的特异性唾液SIGA和血清IgG抗体，另外大肠杆菌的热不稳定毒素B亚单位(LT-B)也被证实能增加连接SPaA多肽的免疫原性和生物学活性。

另外改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段，Senpuku等(1996)发现将PAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段所激发的抗rPAc抗体明显升高，因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性，Smith等(1997)将GTF酶活性片段GGY和AND以赖氯酸为核心分别构建有8条支链结构的多肽疫苗，经唾液周围免疫大鼠，结果显示，将抗原决定簇设计成这种结构具有高度的免疫原性，能诱发高水平的特异性唾液IgA抗体，并使动物龋齿发生率显著降低。

二、被动免疫防龋

被动免疫是直接应用特异性抗体以中和及对抗特异性致病菌的致病作用。由于可能避免主动免疫某些不能预料的副作用，如不会激发系统免疫反应，不会像系统运用防龋疫苗那样引起心脏交叉反应，因此易为人们所接受并日益受到关注。