[发明专利]耐高温β－葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法

说明书

本发明涉及植物转基因中转化体筛选时用的报告基因，尤其是关于耐高温GUS基因序列及其获得方法。

在植物转基因中为了对转化材料进行筛选，标记基因和报告基因被逐渐选用。常用的报告基因是β-葡萄糖苷酸酶(bata-Glucuronidase，GUS)基因，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因和冠瘿碱合成酶基因。1987年，Jefferson首次将GUS基因作为报告基因用于植物的遗传转化(JeffersonR A.，Mol Biol Rpt，1987，5：387-405)。GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)使表达GUS基因的细胞显示蓝色。Hü等(余叔文，汤章城，植物生理学与分子生物学，科学出版社，1988：56-58)测定了包括被子植物和裸子植物在内的52种植物的内源GUS活性，发现对于所测的多种植物在营养阶段并不存在GUS活性，但是在大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中却有明显的GUS活性，随着种子的萌发，GUS基因的活性逐渐消失，因此在利用GUS基因作为报告基因时可有针对性地排除来自植物的假阳性。但是由农杆菌介导的遗传转化，其必不可少的一步是对转化材料进行除菌，否则GUS能够在农杆菌中进行表达，而除菌不彻底时，GUS假阳性就不可避免。为了克服GUS基因的假阳性，Vancanneyt等(Vancanneyt G et al.，Mol Gen Genet，1990，220(2)：245-250)根据真核生物具有原核生物不具有的内含子剪切特性的原理，向GUS基因中引入了一段植物内含子，在农杆菌中没有检测到明显的GUS活性。含有内含子的GUS基因就成为更加有效报告基因。但它还存在缺点：因为大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中有明显的GUS活性，这就成为植物转基因检测的障碍，又因为在农杆菌侵染转化的过程中，由于农杆菌的除菌不彻底，GUS假阳性很严重。从而极大地限制了植物转基因研究的发展。另外，底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)的价格一直居高不下，因为假阳性和本底的存在，必须加大底物的用量，从而又导致了转化成本的上升。

DNA突变(Shuffling)的含义为：在与基因相关的DNA片段群体中，由于大量的随机片段相互参入而导致的重组或突变。随着PCR技术的发展和成熟，DNA Shuffling技术越来越成熟，应用越来越广泛，Stemmer在“DNAShuffling通过随机片段的重组，在体外导致分子进化”一文中具体阐述了DNA Shuffling的成熟技术路线，(Stemmer W P.，Proc natl Acad Sci，1994，91(22)：10747-10751)，一基因经过DNA酶处理变成10到50bp的DNA随机短片段，然后经过两步PCR过程重新得到原来大小和有功能的基因，在重新获得基因过程中，产生大量的突变。从而称之为分子进化(Molecularevolution)。他还采用DNA Shuffling方法在很小的一个基因库中获得了β-内酰胺酶(β-lactamase)的一个突变基因，该基因的表达产量达640μg/ml，是当时任何报道最高水平的32000倍。Patel等(Patel R S.et al.，EMBO J，1987，6(9)：2565-2572)在鼠纤连蛋白基因(rat fibronectin gene)编码的两个亚单元的纤连蛋白研究中，通过Shuffling的方法获得了一些新性状基因，其突变在基因中，甚至在启动子区域中也有较大的突变。

GUS组织化学染色法由于其严重的假阳性，又因为底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄苷酸脂(X-Gluc)的价格居高不下，从而严重地限制了植物转基因的发展，寻找和发掘新的更好、更快、更准确、更价廉物美的报告基因及其获得的方法愈显迫切。在获得新的报告基因工作的探索中，将上述基因突变技术应用于GUS基因的突变是一个很有意义的工作。

为此，本发明目的是提供一个新的报告基因——耐高温GUS基因，本发明另一目的是提供通过DNA突变及耐高温性筛选获得耐高温GUS基因的方法。

本发明提供一种耐高温GUS基因，该基因获得方法包括下列步骤：

(1)、通过DNA突变过程，包括GUS基因PCR扩增；GUS基因PCR产物用DNA酶降解得小片段；小片段进行无引物PCR扩增及取无引物PCR产物加入引物PCR扩增四步，获得GUS基因突变体。