[发明专利]一种新的多肽——二氢叶酸还原酶25.19和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——二氢叶酸还原酶25.19，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

核苷酸的生物合成对于所有的细胞来说都是极其重要的，因为细胞不能从周围介质中摄取核苷酸，而核苷酸是合成DNA和RNA所必需的前体。没有RNA的合成，蛋白质的合成就会停止；没有DNA的合成，细胞就无法分裂。

核苷酸生物合成中的抑制剂对细胞有毒性，其中某些抑制剂用于治疗癌症就是利用这种细胞毒性。此外，核苷酸在代谢的所有主要环节中都起着重要作用，ATP这种腺嘌呤核苷酸是一切生物用来把产能反应中的化学能转移给需能反应的主要物质，其他核苷酸是碳水化合物、脂肪、蛋白质和核酸合成中的活化中间物，腺嘌呤核苷酸是很多重要的辅酶(如NAD⁺、NADP⁺、FAD和CoA)的组份。

5-磷酸-alpha-D-核糖-1-焦磷酸(PRPP)是嘌呤和嘧啶核苷酸合成的前体，由PRPP到第一个完整的嘌呤核苷酸——次黄嘌呤核苷酸(IMP)的途径包括10个步骤。其中，第三步和第九步过程是甲酰基转移，由四氢叶酸衍生物在生物合成反应中从丝氨酸、甘氨酸或甲酸等供体中接受一个1碳单位，并将它转移到1个合适的受体上。IMP在细胞中不会积累，而是转变为AMP、GMP及相应的二磷酸和三磷酸，在接下来的过程中完成核苷酸的合成。

对于DNA来说，胸腺嘧啶而不是尿嘧啶是其重要的碱基，因此，胸苷单磷酸的合成对于提供dTTP十分重要，后者与dATP、dGTP和Dctp一起为DNA复制所需要。胸苷酸的合成的一个主要途径是dUTP甲基化，利用5，10-亚甲四氢叶酸作为甲基的来源，这个反应是叶酸衍生物代谢所特有的，在此反应里，叶酸衍生物既是一碳单位的供体又是还原剂。在此反应中，二氢叶酸是产物，由于叶酸衍生物在细胞里的浓度很低，因此胸腺嘧啶核苷酸的连续合成需要有二氢叶酸再生成5，10-亚甲四氢叶酸。

四氢叶酸是一个传递一碳单位的辅酶，它所传递的一碳单位可以是甲基、亚甲基、甲川基、甲酰基或亚胺甲基等等。

二氢叶酸还原酶可以将二氢叶酸催化生成四氢叶酸，它的活性可以被如氨甲喋呤(methotrexate MTX)等抑癌物质所抑制。在此酶的N末端有Pro-Trp二肽的保守结构，还包含有底物结合位点的色氨酸残基。(Bolin J.T.，Filman D.J.，Matthews D.A.，Hamlin R.C.，Kraut J.J.Biol.Chem.257：13650-13662(1982))

从结构上看，所有生物的二氢叶酸还原酶基本都含有一段保守的特征序列：[LVAGC]-[LIF]-G-x(4)-[LIVMF]-P-W-x(4，5)-[DE]-x(3)-[FYIV]-x(3)-[STIQ]。在众多不同生物的二氢叶酸还原酶中均含有这一序列片段，这一结构基序在二氢叶酸还原酶发挥正常生理学功能的过程中起着极为重要的作用。

编码人的二氢叶酸还原酶的基因被定位于人染色体的5q11.2-ql3.2位置。(Mol Cell Biol 1984 Oct；4(10)：2010-6)

除了直接影响胸苷酸的合成外，人的二氢叶酸还原酶对于嘌呤、嘧啶和一些特定的氨基酸的合成有重要的意义。

在核苷酸生物合成的抑制剂中有一种抑制剂的原理是，通过减少包括甲川四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸(嘌呤合成所需)以及亚甲四氢叶酸(胸苷酸合成所需)在内的四氢叶酸衍生物的水平，间接阻止核苷酸的生物合成。氨甲喋呤、三甲氧苄二氨嘧啶以及不少有关的化合物是叶酸的结构类似物，结合在二氢叶酸还原酶的催化部位上，从而起到阻止复制中的细胞合成胸苷酸和嘌呤核苷酸的作用。

很早的时候，就已有研究表明，人二氢叶酸还原酶的缺乏会导致巨成红细胞的贫血症。(N Engl J Med 1976 Feb 26；294(9)：466-70)

如果人二氢叶酸还原酶的编码基因发生了突变，则会造成氨甲喋呤的化学治疗疾病的过程受影响，因为氨甲喋呤通过抑制由二氢叶酸还原酶催化的二氢叶酸至四氢叶酸的还原反应来治疗癌症等疾病。(Hum Mutat 1998；11(4)：259-63)