[发明专利]以具有催化活性的核酸为基础的诊断方法

说明书

在本申请中，引证了各种文献。这些文献的内容作为参考文献编入本申请以更充分地描述本发明涉及的领域的现状。

本发明涉及诊断特征为已知核酸突变的疾病的方法。本方法采用有催化活性的核酸分子，并用于与诸如癌症和AIDS的疾病的诊断结合。

各种遗传和获得性疾病与诸如点突变，缺失和插入的遗传改变相关。一些改变直接与疾病的存在相关，而其它改变与疾病风险和/或预后相关。有500种以上的遗传疾病由单个基因的突变引起(21，22)。它们包括囊性纤维化，肌肉营养障碍，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿症，镰状细胞贫血病或特性，各种其它的血红蛋白病(21，22)。而且，对一些常见多基因病症，如动脉粥样硬化心脏病敏感性增加的个体显示出与特定DNA序列多态性的遗传相关。

据认为癌症是由于涉及细胞增生或分化的基因中遗传损伤的积累而形成的。ras原癌基因，K-ras，N-ras和H-ras，以及p53肿瘤抑制基因是人癌症中经常突变的基因的例子。在这些基因中特定的突变导致转化潜力增加。在评价疾病风险，疾病的诊断，预测病人的预后或对治疗的反应的临床中遗传分析是无法估价的。然而，引入这类遗传试验取决于开发简单，廉价且迅速的试验用于遗传改变。

体外核酸扩增的方法已广泛应用于遗传学和疾病的诊断中。在最近10年中，已描述了许多核酸扩增技术。它们包括聚合酶链反应(PCR)(1-7)，连接酶链反应(LCR)(8)，链置换扩增试验(SDA)(9)和转录介导的扩增(TMA)(10，11)(也称为自我维持的序列复制(SSR))。由PCR，LCR和SDA产生的扩增产物(扩增子)为DNA，而TMA产生RNA复制子。可分析由这些方法或其它方法产生的DNA或RNA模板以确定与疾病相关的序列改变(即突变)的存在。

使用核酸扩增，最近几年深入研究了催化性核酸。使用催化性核酸作为治疗剂抑制基因功能的潜力在文献中已广泛讨论(12-18)。已表明有催化活性的RNA分子(核酶)能裂解RNA(12)和DNA(17)分子。同样，也显示催化性DNA分子(DNAzymes)能裂解RNA(13，19)和DNA(18)分子。催化性核酸仅能裂解靶核酸序列，只要靶序列能满足最小序列要求。靶序列必须与催化核酸的杂交区互补且靶必须在裂解位点含有特定序列。在裂解位点需要这种序列的例子包括一类DNA zyme裂解(10-23类型)对嘌呤：嘧啶序列的需要(19)，锤头核酶对序列尿嘧啶：H的需要，其中H可等于A，C或U，但不能是G(23)。

除了其治疗性潜力外，催化性核酸分子也能区分其区别在于单个点突变的靶(14-16)。经过靶向存在于野生型而突变性模板不存在或刚好相反的特异性序列来实现这点。至今，这种区分能力仅被用作基因表达治疗性改造的方法。

Nollau-Wagener(24)的综述就所分析的核酸类型，检测的突变百分数，进行试验的时间和花费，涉及使用有毒试剂的问题比较了一些用于点突变检测的方法。每一种检查的方法均有其缺点。例如，变性梯度凝胶电泳耗时，RNA酶裂解仅能检测大约70％可能的突变，化学裂解涉及使用有毒物质。

称为限制性片段长度多态性(RFLP)的另一方法涉及确定在感兴趣的基因座上是否存在限制性酶位点。在极少情况下，可检测到突变，因为它们碰巧位于天然存在的限制性核酸内切酶识别/裂解位点内(31)。

用于帮助体外扩增的引物内含有错碱基可能导致引入人工限制性核酸内切酶识别/裂解位点，因此，可用RFLP分析的基因座数目增加(32)。含错配碱基的修饰引物用于在ras基因家族内关键密码子上引入限制性核酸内切酶的人工识别/裂解位点。在靠近引物3′端设计含有错配碱基的引物的一般规则已经建立(36)。

尽管使用错配引物拓宽了RFLP分析的实用性，但该技术仍受这一事实的限制，即限制性酶识别和裂解最少需要4个碱基对。

本发明提供了确定受试者是否患有其特征在于存在已知核酸突变的疾病的方法，该方法包括如下步骤：(a)从受试者中分离核酸分子样品；(b)(i)扩增分离样品中存在的核酸片段，该片段已知在患有该疾病的受试者中含有突变，(ii)在合适的条件下，接触所得的扩增片段与催化性核酸分子，该催化性核酸分子特异性地识别和裂解(1)在具有已知突变的核酸片段中或(2)在相应的野生型核酸片段中，但不是两者中同时存在的靶序列，前提是步骤(ii)可在步骤(i)之后或同时进行；和(c)，测定步骤(b)(ii)中催化性核酸分子是否裂解扩增片段，以确定受试者是否患有该疾病。