[发明专利]一种检测探针的制备方法及用途

说明书

本发明涉及一种生物技术检测工具，具体地说是一种检测探针及其使用方法和它在基因荧光定性、定量杂交分析、医学诊断等生命科学研究中的应用。

多聚酶链式反应(PCR)可以连续扩增特定的基因片断，产生放大效应，目前已经被广泛而成功地用于获取某一目的基因。PCR在基因诊断方面同样具有广阔的应用前景，但一些问题限制了它的实际使用，主要问题有两点，一是不能准确定量；二是因为过于灵敏，易发生交叉污染，产生假阳性。为克服上述不足，人们采取了许多方法，如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术(fluorescende resonance energy transfer，简称FRET，下同)用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。

目前，实时PCR监测技术主要有四种。TaqMan技术是由PE公司开发的，该技术主要利用了Taq酶的5’外切酶活性。首先合成一个能与PCR产物杂交的探针，探针的5’端标记一种荧光分子，3’标记另一种荧光分子，3’端荧光分子能够吸收5’端荧光分子发出的荧光。正常情况下该探针没有荧光，但当溶液中有PCR产物时，探针与PCR产物结合，激活Taq酶的5’外切酶活性，5’端切割下来的荧光分子与3’端荧光分子连接后，探针发出荧光。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的浓度[Livak KJ.Allelic discrimination using fluorogenic probesand the 5’nuclease assay.Genet Anal 1999 Feb；14(5-6)：143-9]。分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是，探针5’和3’末端可以分别形成一个8碱基左右的发卡结构。荧光分子和淬灭分子邻近时，不会产生荧光；而当溶液中有特异模板时，探针与模板杂交，探针的发卡结构破坏，产生荧光。荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此该技术也可用于PCR定量分析[Bialy H.Detecting drug-resistant tuberculosis：Beacons in thedark.Nat Biotechnol，1998，16：331.4.Piatek，AS，Tyagi S，Pol AC，et al.Molecular beacon sequence analysis for detecting dmg resistance inMycobacterium tuberculosis.Nat Biotechnol，1998，16：359-363]。Amplisensor是一种复合探针技术。它包括长度不同，但具有互补序列的两个探针，短探针上连接淬灭物，长探针上连接荧光物，长探针5’端多出的7个碱基GCGTCCC可以与PCR引物互补。PCR扩增前，两探针杂交在一起，溶液中没有荧光；PCR扩增时，在连接酶的作用下长探针与PCR引物连接，长探针一引物复合物中的代引物部分作为半套式引物参入模板，淬灭探针释放，破坏了FRET，从而产生荧光，荧光的强度与扩增时加入的模板量成正比[Chiang PW.Song WJ，Wu KY，et al.Use of a fiuorescent-PCR reaction to detect genomicsequence copy number and transcriptional abundance.Genome Res.1996，6(10)：1013-1026.]。LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子，淬灭探针的3’端连接淬灭分子。由于设计的两个探针可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析[Sagner G，Goldstein C，Miltenburg RV.Detection of multiple reporter dyes in real-time，on-linePCR analysis with the LightCycler system.Roche MolecularBiochemicals BIOCHEMICA，1999，2：7-11]。上述FRET技术均存在一些缺陷，如淬灭不彻底，合成和标记复杂，成本高，非特异扩增不易区分等等。本发明人在综合现有技术优点的基础上，发明了一种新的FRET探针技术，该技术在很大程度上克服了现有技术的不足。