[发明专利]高效表达乙肝表面S(主蛋白)和前S1(大蛋白)融合抗原的转基因哺乳动物细胞系

说明书

我国是乙型肝炎高发区，有50-70％的人群感染过HBV,10％的人群(约1亿多人)为带毒者。目前还没有治疗乙肝的有效方法，接种乙肝疫苗是预防肝炎的有效措施。

血源疫苗国内外已投入生产使用，由于血源疫苗存在着一些问题，如血源有限，带有肯定的潜在性危险(如丙肝、艾滋病毒等)，为此需要急切研制乙肝基因工程疫苗。国内外对乙肝基因工程疫苗的研究已得到较快的发展，美国的MSD公司应用酵母系统生产乙肝基因工程疫苗已获生产许可证。我国预防医学科学院病毒研究所用哺乳动物细胞生产的乙肝基因工程疫苗也获正式生产文号。

目前使用的基因工程疫苗和血源疫苗一样，都是由乙肝表面抗原主蛋白(S)组成，该疫苗免疫原性低，用量大，约有10％左右人群对其无免疫反应或反应低下，另外已发现对主蛋白的免疫逃逸突变株，因此研究含有PreS1和PreS2的新型乙肝疫苗已受到各国科学家的重视。以色列[5]使用天然结构研制的CHO细胞表达的含PreS1和PreS2的疫苗也显示出很好的免疫效果。其使用量降低到2.5ug，与常规10ug量的疫苗相比，同样产生较高的抗体滴度。史克公司[6]也构建了改造的大蛋白L^*，并能在酵母中稳定表达PreS1,PreS2和S，在小鼠中也诱生相应的抗体，但临床试用结果并非特别优越。

1984年M.L.Michel[1]应用ayw亚型的乙肝病毒表面抗原大蛋白构建重组质粒，其特点是乙肝表面抗原大蛋白受SV40早期启动子的调控，而dhfr(二氢叶酸还原酶)扩增基因受MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)启动子的调控，表达系统应用二氢叶酸还原酶阴性的中国地鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)蛋白电泳显示出22KD,26KD的主蛋白及34KD的中蛋白条带，未显出大蛋白条带，其表达量为1ug/10⁶细胞/每天。

1986年P.Dehoux等[2]用ayw亚型构建含乙肝表面抗原大蛋白基因的重组质粒，其大蛋白基因在PHO5(强酵母启动子)调控下，在酵母中进行表达其表达产物免疫沉淀后，蛋白电泳出现39KD的带条。蛋白分泌量为25ug/L。

1989年T.Lee et al[3]应用adr亚型乙肝表面抗原天然大蛋白构成重组质粒，HBsAg基因的转录方向与SV40早期启动子方向相反，dhfr为扩增基因，在CHO细胞中表达，其产量平均为1ug/10⁷细胞/每天，蛋白印迹实验：用PreS1及PreS2单克隆抗体能分别测出40KD的PreS1及33KD,36KD的PreS2带。

西德的Hexal Biotech公司[4]应用改造的大蛋白疫苗(含PreS1 PreS2和S)临床观察有很好的效果，接种一代后抗体阳转率可达100％，对S疫苗无反应者也有效。国内，上海生化研究所研制出乙肝表面抗原主蛋白羧端融合了肝细胞受体结合位点PreS1(21-47)的融合抗原(14)，此融合抗原在哺乳动物细胞CV-1中能表达和分泌乙肝表面抗原S和PreS1的嵌合颗粒，免疫小鼠能同时产生高滴度的抗S和抗PreS1抗体，该结构已申请了专利，申请号：94112069.4公开号：CN1108306A。

表达系统中扩增基因的选择是直接影响基因表达水平的重要因素之一，现有表达HBsAg主要使用m-dhfr[7,8]及PBV[9,10]作为扩增基因，但都存在一些不足之处。谷氨酰胺合成酶(GS)基因是最近几年来发展起来的作为扩增选择标记基因之一，具有较高的表达效率[11]。中国预防医学科学院病毒学研究所利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)作为扩增基因成功的在CHO细胞中高效表达了乙肝表面抗原S基因[15]，此表达系统已申报专利，申请号：96100703.6

综上所述，含乙肝病毒表面抗原PreS1、PreS2和S的大蛋白均已在CHO细胞或酵母中获得表达，主要有天然的和改造的二种结构，但所有结构的表达效率均较低，一些结构产物不稳定，含PreS1的成分较低。由于PreS1不仅具有B细胞表位，同时有T细胞表位，能引导产生较强的细胞免疫，可增强乙肝表面S区的免疫原性。因此使用S+S1基因构建可获得含PreS1的乙肝表面抗原高效表达质粒结构，并获得相应的高效表达细胞系就成为本发明的主要目的。含乙肝表面抗原S+前S1重组质粒的构建：