[发明专利]运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法无效
申请号: | 00124700.X | 申请日: | 2000-09-29 |
公开(公告)号: | CN1285408A | 公开(公告)日: | 2001-02-28 |
发明(设计)人: | 章军;楼士林;徐虹;罗田 | 申请(专利权)人: | 厦门大学 |
主分类号: | C12N15/63 | 分类号: | C12N15/63;C12N15/31;C12N1/13;A61K38/16 |
代理公司: | 厦门大学专利事务所 | 代理人: | 陈永秀,马应森 |
地址: | 361005 *** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 运用 基因 整合 平台 系统 进行 蓝藻 转基因 表达 胸腺 方法 | ||
1.运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法,其特征在于按设计从蓝藻Calothrix 7601染色体DNA上PCR扩增出藻蓝蛋白cpc2启动区、整合平台同源片段L和R,组装了含cpc2启动子、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因平台同源序列等元件的供体质粒pUTK,建立了Calothrix 7601新的基因整合平台系统,获得了转UBTα1基因的藻株,其具体方法步骤如下:
(1)cpc2启动区(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆
根据丝状蓝藻Calothrix 7601的cpc2操纵子的启动区P以及同源片段L和R这三个片段两端的核苷酸序列分别设计三对PCR引物P1和P2,L1和L2,R1和R2,其序列如下:
P1(5’端引物):5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’
SalⅠ
P2(3’端引物):5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’
SphⅠ
L1(5’端引物):5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’
EcoRⅠ
L2(3’端引物):5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’
SalⅠ
R1(5’端):5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’
SalⅠ
R2(3’端):5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’
HindⅢ
其中启动区左端引物P2设计了一个SphⅠ酶切位点,其序列为GCATG↓C,以Calothrix7601的染色体DNA为模板,按常规的PCR技术分别扩增出0.6kb片段P,1.2kb片段L和1.2kb片段R;根据引物中的酶切位点,用SphⅠ和SalⅠ同时双酶切片段P和载体pUC19,然后用T4 DNA连接酶连接,连接物转化受体菌E.coli JM101,用蓝白筛选得到白色克隆子,得重组质粒pUCP;用HindⅢ和SalⅠ同时双酶切片段R和载体pUC19,然后用T4 DNA连接酶连接,连接物转化受体菌E.coli JM101,用蓝白筛选得到白色克隆子,得重组质粒pUCR;用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切片段L和重组质粒pUCP后,用T4 DNA连接酶连接,连接物转化受体菌E.coli JM101,用蓝白筛选得到白色克隆子,得重组质粒pULP;
(2)外源供体片段DNA的克隆:
a.卡那霉素-Kmr报告基因和rbcS polyA终止区的克隆:
选择含有报告基因卡那霉素-Kmr和终止区rbcS polyA两个片段的质粒pKYLX71,用XbaⅠ和SalⅠ双酶切pKYLX71,胶回收4.8Kb的DNA片段,与经同样双酶切的重组质粒pUCR连接,连接物转化E.coli JM101,以含有Ap和Km的双抗培养基筛选,获得了8.7kb的重组质粒pUKR;
b.目的基因UBTα1的获得及克隆:
按Tα1基因的序列设计了以下PCR引物T1、T2和T2’:
T1(5’端片段):5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTT
SphⅠ BarnHⅠ
GACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3(65Nts)
T2(3’端片段):5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAAC
SpeⅠ
AACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(65Nts)
T2’(3’端引物):为T2之5’端的前25个核苷酸
以T1和T2为引物,按常规PCR扩增得Tα1片段,以质粒pUCUB为模板,引物为U1和U2,PCR扩增出UB片段,用BamHⅠ酶切Tα1和UB片段后连接,再以此连接物为模板,以U1和T2’为引物扩增获得UBTα1片段。用XbaⅠ和HindⅢ不完全酶切pUKR,回收6.0Kb片段,用SphⅠ和SpeⅠ双酶切目的基因UBTα1;用SphⅠ和HindⅢ双酶切pULP,将以上三种酶切片段混合后连接,转化,以Ap和Km双抗筛选,获得了供体质粒pUTK;
(3)供体质粒pUTK电激转化Calothrix 7601
用EcoRⅠ完全酶切pUTK,获得线状质粒pUTK,在电压0.4~2.0kv,电阻100~200Ω,时间2.5~5.0ms、电容25μF的条件下电激转化蓝藻Calothrix 7601,将经电激处理后的转化藻株经培养,以Km筛选,获得转UBTα1基因的藻株。
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