[发明专利]含有编码扩展酶的DNA的表达载体及用其转化的宿主细胞

说明书

本申请是申请日为1992年9月10日，申请号为92112278.0，发明名称为“制备7—ADCA的新的生物方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明属于制备商品头孢菌素抗菌素的合成方法领域，目前此类抗菌素已有很多，这些治疗剂是第四代产品。由于商品头孢霉素中存在大量的各种各样的侧链以及头孢菌素显著的经济上的重要性因而使得成功制备关键性中间产物的更经济，更有效的方法变得日益重要，这些中间产物便于头孢菌素的快速合成。

这些关链的中间产物之一是7-氨基去乙酸基头孢菌烷酸(7-ADCA)，该物质用下面通式表示：目前，7-ADCA是从青霉素G中产生的，并且需要4或5个化学步骤以将青霉素环系从5员环扩展到代表头孢菌素特征的六员环。由于该方法是典型的全部化学合成过程，因而存在严重的缺陷。这些缺陷是该方法需要多个步骤，是一个复杂的过程，需要昂贵的试剂，产生很多副产物导致污物处理问题，以及需在化学处理开始前对高度不纯的起始材料加以纯化。因此，人们在不断探索研究一种微生物或发酵方法，通过酶促反应使环扩展以及切割侧链，从而以比目前使用的化学方法更经济地的方法提供7-ADCA。

因此，具体地说，本发明涉及制备关键的头孢菌素中间产物7-ADCA，更具体地讲，本发明涉及制备7-ADCA的生物方法。

已证明，到目前为止，在探索制备7-ADCA的成功的生物方法方面的研究都没有取得成效，肯定对一种工业生产规模而言确实如此。例如，利用直接的发酵法和/或通过酶促处理青霉素G时，可以制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)，仅再需产生7-ADCA所必需的环扩展步骤，不幸的是，已发现在这些微生物的正常代谢途经中进行环扩展的头孢子菌属或链霉菌属酶并不以6-APA作为底物。在本领域内将这些酶统称为DAOCS或扩展酶，定义为催化青霉素型分子中存在的Penam环结构扩展为Ceph-3-em环(如头孢菌素中存在的结构)的酶。下文中，将这些酶称为“扩展酶”。

该扩展酶作用的底物是青霉素N，使其环扩展获得脱乙酸基头孢菌素C(DAOC)。这里，只需要切除(D)-a-氨基己二酰侧链以得到7-ADCA，但已证明该侧链对酶促切割具有顽强的抗性，仅能获得低得没什么价值的产量。

按照本发明，可以获得一种有效的生物方法，其中利用新的发酵方法以高效价生产青霉素化合物(有一个己二酰侧链)，所说的青霉素化合物是一种可为扩展酶系接受的底物，该扩展酶系是由能产生青霉素化合物的同样的微生物原位产生的，该微生物已被转化并表达所说的扩展酶系。然后该扩展酶作用青霉素化合物进行环扩展产生高产量的头孢菌素化合物。并且重要的是在第二个关键步骤中，可通过另一酶系以惊人的高产量移去青霉素化合物(即眼下的一种头孢菌素化合物)的侧链。包含本发明的这种独特生物方法的意外结果是以惊人的高产量生产7-ADCA。

在Curr.Genet.(1990)17：213-221上Cantwell等人建议了一种通过对青霉素V进行环扩展，然后通过酶促水解得到的去乙酸基头孢菌素V而形成7-ADCA而制备7-ADCA的生物方法。该方案的根据是从S.clavuligerus可得到的一个克隆青霉素N扩展酶基因(cefE)(Kovacevic等人，J.Bacteriol.(1989)171：754-760和U.S.5,070,020)。但是，由于该扩展酶作用于青霉素N，其天然底物，而不作用于青霉素V，该方案需要通过遗传工程操作而产生能扩展青霉素V环的经过修饰的扩展酶基因。然而Cantwell等人没有获得所需的修饰，他们仅成功地用Streptomyces Clavuligerus的cefE基因转化产黄青霉菌，并得到低水平表达DAOCS(扩展酶)酶。