[发明专利]一种新的多肽——NAD－依赖的2－羟酸脱氢酶家族蛋白24.53和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——NAD-依赖的2-羟酸脱氢酶家族蛋白24.53，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

真核类细菌及植物中有一系列NAD-依赖的对其底物的D-同分异构体显示特异性的2-羟酸脱氢酶，它们催化一些重要的代谢步骤，在功能及结构上相关，被归为一个家族，现已发现的种类如下所列：

1)D-乳酸脱氢酶，一种催化D-乳酸还原为丙酮酸的细菌酶类。

2)D-甘油酸脱氢酶(NADH-依赖的羟基丙酮酸还原酶)，一种催化羟基丙酮酸还原为甘油酸特异的植物叶子过氧化物酶体的酶。该反应是光呼吸的乙醇酸途径中的一部分。

3)细菌Hyphomicrobium methylovorum及Methylobacterium extorquens的D-甘油酸脱氢酶。

4)3-磷酸甘油酸脱氢酶，一种催化D-3-甘油酸氧化成3-磷酸羟基丙酮酸的细菌酶类。该反应是丝氨酸生物合成的‘磷酸化’途径中的第一个关键步骤。

5)Erythronate-4磷酸脱氢酶(基因pdxB)，一种参与吡哆醇(维生素B6)生物合成的细菌酶类。

6)D-2-羟基异己醛(D-hicDH)，一种催化2-酮羧酸及D-2-羟基羧酸间可逆兼立体特异的互相转换的细菌酶类。

7)甲酸脱氢酶(FDH)，来自细菌甲单胞杆菌sp-101以及不同的真菌。

8)万古霉素抗性蛋白，来自肠道球菌faecium；该蛋白是一种参与形成不被D-丙氨酸终止的肽聚糖从而阻止万古霉素结合的D-特异性α-酮酸脱氢酶。

9)大肠杆菌假拟蛋白ycdW。

10)大肠杆菌假拟蛋白yiaE。

11)流感嗜血杆菌假拟蛋白HI1556。

12)酵母假拟蛋白YER081w。

13)酵母假拟蛋白YIL074w。

该家族成员有许多共同点：都作用于羟酸D-同分异构体；NAD结合域较为相似，催化域作用特异性底物，因而各有不同；具有相同的NAD结合域结构，该结构为βαβ-折叠，序列为[LIVMA]-[AG]-[IVT]-[LIVMFY]-[AG]-x-G-[NHKRQGSAC]-[LIV]-G-x(13，14)-[LIVfMT]-x(2)-[FYwCTH]-[DNSTK]，十分保守，富含甘氨酸；结合的辅酶自脱辅基形式转换为完整形式，该家族成员都会发生构像改变，但具体情况各不相同；它们的催化效果一致，封闭底物裂缝及防止酶活性中心被溶解(从脱辅基到完整的构像转换)，集中活性位点以及定位与烟酰胺的催化C-4位置有关的功能氨基酸残基，催化域的转动致使通过多肽链的羧基端部分自大量溶剂中有效筛选NAD⁺，而封闭活性位点的第二个入口致使烟酰胺部分的C-4原子附近的重要催化残基被有效取代，所有NAD⁺依赖的脱氢酶催化的一个重要因素即增强辅酶烟酰胺部分的C4N亲电子性，这可通过与带负电配基相互作用且由于氨甲酰基团对吡啶平面扭曲而干扰其基态的NAD⁺氨甲酰基团足够的极化而得到，在NAD⁺依赖的脱氢酶中这样辅酶的氨甲酰基团位于平面之外十分普遍。

综上所述该家族成员都具有相同的酶活性，且结构上具相关性。我们选择了最为保守区域中的三个区域以开发模板。其中第一个模扳即上面所说的与NAD结合域相关，位于中心部位的富含甘氨酸的区域。另外两个模板位于催化域，含有一些保守的带电残基，其中有的可能在催化机制中起作用，其序列分别为[LIVMFYWA]-[LIVFYWC]-x(2)-[SAC]-[DNQHR]-[IVFA]-[LIVF]-x-[LIVF]-[HNI]-x-P-x(4)-[STN]-x(2)-[LIVMF]-x-[GSD]与[LMFATC]-[KPQ]-x-[GSTDN]-x-[LIVMFYWR]-[LIVMFYW](2)-N-x-[STAGC]-R-[GP]-x-[LIVH]-[LIVMC]-[DNV]，大肠杆菌D-乳酸脱氢酶(基因为dld)中不含有后一种序列，该酶是一种膜结合FDA黄素酶。前一种序列由组氨酸/羧化/精氨酸构成一个保守的催化域，紧靠该家族成员脱辅基酶的活性位点，并位于完整形式的烟酰胺环的附近。后一种序列中的天冬氨酸-组氨酸形成一个保守的催化对。