[发明专利]一种新的多肽——人细胞凋亡相关蛋白30.58和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——人细胞凋亡相关蛋白30.58，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

程序性细胞死亡(PCD)是多细胞生物体在发育过程中特异类型细胞的消除，是生理条件下严格调控的(1)。程序性细胞死亡是通过细胞凋亡进行的，而细胞凋亡指的是进行程序性细胞死亡的细胞的可以观察到的形态变化。包括细胞膜发生小泡、细胞皱缩、染色体凝集和DNA分解(2)。这个过程在细胞碎片变成凋亡小体时达到了顶峰，在体内这些凋亡小体很快被周围的细胞吞噬(3)。细胞凋亡是生物体的许多不需要的细胞的缺失方式，对胚胎发育、形态发生、炎症消除、造血和免疫细胞的成熟以及维持正常组织和器官的细胞数目恒定与生长平衡、以至机体衰老方面其着重要作用，所以细胞凋亡对于多细胞生物维持形态的完整、正常的生理功能方面起着非常重要的作用(4)如果细胞凋亡发生错误会导致肿瘤发生、自身免疫疾病和爱滋病的发生(5)。

细胞凋亡是在自杀信号(suicide signals)通过与其受体的结合而触发了信号传导，最后导致了细胞死亡。许多分子能够调节死亡路径或控制死亡信号传导。构成凋亡机制的核心成分和相关的分子机理从线虫到人是非常保守的(6)。线虫的cde3、cde4、cde9三个基因与细胞凋亡有关。哺乳动物方面，人们把注意力集中到了白细胞介素1β(IL-1β)转化酶相关蛋白酶方面，这是一个至少包括10种哺乳动物半胱氨酸蛋白酶的家族，它们统称为caspase，这些蛋白酶导致了细胞的凋亡，表现为：1，过度表达这些蛋白酶会导致细胞凋亡；2，细胞通过分级激活这些蛋白酶导致细胞死亡(7)。

另外：许多证据表明，细胞内钙离子浓度的改变控制细胞凋亡方面起着重要作用。DNA片段化是细胞凋亡的一个重要特征，它的形成依靠钙离子激活的内切核酸酶。诱发细胞凋亡的同时也使细胞内的钙离子浓度升高，细胞内的钙离子螯合剂可以细胞抑制凋亡，在Fas刺激下，钙离子迅速从细胞内的初创储藏处释放出来，说明细胞凋亡的过程存在钙离子敏感的步骤(8)。

Pasquale，Vito(9)等为了了解与凋亡有关的基因，使用了一个他们命名为″死亡陷井″的系统”。它的原理是；用构建在哺乳动物表达载体pLTP的鼠cDNA文库感染鼠T-细胞杂交瘤(3DO)，应该能够保护一些细胞免受外界因子诱发的细胞凋亡.结果他们筛选到了6个cDNA克隆，命名为ALG-1到ALG-6(Apoptosis-linked genes)，能够抑制TCR诱发的细胞凋亡。其中ALG-2是一种钙结合蛋白，它的存在与细胞凋亡有关。转染了反义cDNA(从而抑制了ALG-2蛋白产生)的T细胞能够抵抗许多因子诱发的细胞凋亡。

ALG-2由一条多肽链组成，分子量为22KDa，包含了5个称为EF臂的钙离子结合位点。体外研究表明：钙离子不存在条件下，ALG-2形成弱的特异二聚体。缺失了羧基端或氨基端的ALG-2还能够结合钙离子，表明ALG-2有两个结构域，N端结构域有两个钙离子结合位点，C端有三个钙离子结合位点，第5个EF臂与二聚体的形成有关。钙离子对于ALG-2的聚集是不可确实的，钙离子与ALG-2的结合使ALG-2的N-端和C-端构象发生了变化(7)。

由于ALG-2在鼠3DO细胞凋亡过程中的是组成形表达的，所以ALG-2是通过依赖钙离子的机制在caspase的下游发挥作用(9)。为了寻找与ALG-2相互作用的蛋白，Missoto M利用免疫共沉淀方法研究与ALG-2相互作用的蛋白质。结果表明ALG-2在没有钙离子的条件下与自身形成同源二聚体，在有钙离子存在的条件下ALG-2与一种新的蛋白质-Alix(ALG-2 interacting protein X)形成异源二聚体，而且表明钙离子与ALG-2结合后，它们才能相互作用(10)。

另外，Alix与S.cerevisiae的蛋白质BRO1有很高的同源性(10)，而BRO1是PKclp-Map激酶途径的一个成员，BRO1发生突变回导致温度敏感的突变，这种突变可以被钙离子所抑制。表面ALG-2/Alix可能通过激活与MAP激酶有关的信号突击发挥作用(8)。

通过基因芯片的分析发现，在正常脑、肝癌、肌肉、胎脑、胎肾，胎肺、胎肝、甲状腺、胸腺、成人肝、肺、胶质瘤中，本发明的多肽的表达谱与人细胞凋亡相关蛋白的表达谱非常近似，因此二者功能也可能类似。本发明被命名为人细胞凋亡相关蛋白30.58。