[发明专利]重组人表皮生长因子、其制备方法和药物组合物

权利要求书

1.工程菌株EE-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为No.02787-1。

2.重组人表皮生长因子的制备方法，包括以下步骤：

用大肠杆菌偏爱的密码子构建和克隆合成的hEGF基因；

构建和克隆碱性磷酸酯酶启动基因和信号肽序列基因片段phoA-P+sig；

构建表达质粒pAE-8；

用表达质粒pAE-8转化宿主菌并筛选得到工程菌株EE-8；

将工程菌EE-8在控制无机磷含量的Lpi培养基中培养，诱导表达rhEGF。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述的大肠杆菌偏爱的密码子为：

   5’AATTCCGACT         CTGAATGCCC        GCTGTCTCAC

      GACGGTTACT         GCCTACACGA        TGGTGTTTGC

      ATGTATATCG         AAGCTCTGGA        CAAATACGCG

      TGCAACTGTG         TTGTTGGTTA        CATCGGTGAA

      CGTTGCCAGT         ACCGTGACCT        GAAATGGTGG

      GAACTGCGT          3’

4.如权利要求2所述的方法，其中所述表达质粒pAE-8的构建步骤是：将所述hEGF基因片段与phoA-P+sig基因片段连接后，再与经PstI、Hind III酶切的pTZ18R质粒相连接，转化JM103菌，筛选出表达质粒pAE-8。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述宿主菌为碱性磷酸酯酶缺失的大肠杆菌YK537，其基因特征为：F^-leuB6 thi hsdR hsdM lacy rpsL20 galk2 ara-14xyl-5 mtl-1 supE44 endl^-phoA8 recA1。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述控制无机磷含量的Lpi培养基的配方如下：

每50ml液体培养基中含(氨苄青霉素钠最终浓度为100μg/ml)：

Polypepton             0.5g              酵母提取物          0.05g

1M Tris Cl(pH7.2)    2.5ml             葡萄糖              0.5g  

MgSO₄7H₂O            0.05g             饱和酚红            100μl

7.如权利要求2所述的方法，进一步包括中试规模的发酵和分离纯化工艺，发酵培养基含Polypepton2％、酵母提取物1％、无水硫酸镁0.05％、无水葡萄糖3％及磷酸盐缓冲剂，工程菌种子液经扩大培养后按2％比例接种于100升发酵培养基，37℃发酵18小时后进行高速离心、超滤浓缩和色谱分离。

8.一种治疗消化道溃疡用的药物组合物，包含人表皮生长因子或其衍生物和药学上可接受的辅料，其中所述人表皮生长因子或其衍生物的含量为0.001-2000μg/ml或0.001-2000μg/g。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述的药学上可接受的辅料为糊精、羟丙基甲基纤维素和卡波姆。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其剂型为胶囊。