[发明专利]一种核酸分子扩增和标记方法

说明书

本发明涉及一种核酸分子扩增标记方法。

脱氧核糖核酸(DNA)的扩增方法一般为聚合酶链反应(PCR)。一典型的聚合酶链反应是由二个特异性引物分子与靶分子的两条互补链杂交，并在聚合酶的作用下从5’→3’延伸，由此把一个双链的DNA分子扩增成二个双链分子，反复此过程可得到大量的DNA分子。一个复合聚合酶链反应需要有多对特异性的引物，因而反应成本较高。由于聚合酶对经修饰的非自然核苷酸的亲和力较低，所以用PCR方法同时用作扩增和分子标记方法往往难以达到理想的效果。另外PCR扩增的效率与被扩增的分子的碱基序列结构有直接的关系，在进行复合聚合酶链反应时，不同的靶分子难以同时进行平衡扩增。另一种分子扩增的方法是使双链的DNA分子与启动子连接，然后用核糖核酸聚合酶把DNA转录成单链的核糖核酸(RNA)。用转录的方法可以把DNA平衡扩增成大量的RNA，同时可对RNA进行分子内标记，但转录方法的扩增能力一般在数百倍左右，因此单用转录的方法难以把极微量的核酸扩增至可用的量。

本发明的目的是提供一种核酸分子扩增和标记的方法，它能克服现有技术的上述不足。

一种核酸分子扩增和标记方法，包括聚合酶链反应和转录反应，其特征是进行聚合酶链反应前，把DNA的3’末端用末端转移酶进行延伸，然后用与延伸序列互补的附带启动子的引物及与5’端特异的引物进行PCR扩增，此后用RNA聚合酶把经PCR扩增的DNA产物扩增成标记的RNA。

本发明的优点是进行PCR扩增时3’端的引物为非特异性的但带有启动子序列，因此进行PCR时，省去了一半的特异性引物，使反应成本降低，同时PCR产物可用于转录扩增，最终可得到大量的被标记的核酸分子。

下面通过实施例说明本发明。

对一DNA样品中的10个靶片段进行扩增时，首先把这一DNA样品随机切成平均1000碱基长的片断，然后在每个片段的3’末端用末端转移酶(TdT)加上平均20个A碱基。用这些经修饰的样品进行PCR反应，所用的引物是与10个靶片段5’端相对应的引物，以及带T7启动子序列的(T)₂₀寡聚核苷酸作为3’端引物。经30个周期的PCR反应后，把扩增所得的DNA提纯，然后用于RNA转录反应，反应中所用的核苷酸包括荧光素标记的核苷酸，反应的最终产物是大量的与10个靶分子(片段)序列相应的被标记的RNA分子。最后用基因芯片检测这些标记的RNA分子的特征结构。