[发明专利]一种体外免疫人B淋巴细胞生产人单克隆抗体的方法

说明书

本发明属于生产人单克隆抗体的生物技术领域。

本发明提供了用加载抗原的人树突状细胞免疫人外周血单核细胞，然后用EB病毒转化其中的产生特异性抗体的B淋巴细胞进而生产单克隆抗体的方法，本方法既适用于在实验室水平制备人单克隆抗体，也适用于人单克隆抗体的工业化生产。

单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)是由克隆的B淋巴细胞产生的只识别某一特定抗原决定簇的高度均质和高度专一性的纯化抗体。Milstein和Kohler在1975年报道了生产单克隆抗体的杂交瘤技术，并因此在1984年获得诺贝尔奖。生产单克隆抗体的杂交瘤技术的要点是：用特异性抗原免疫小鼠；把小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；分离单克隆的产生抗体的杂交瘤细胞；将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔或体外培养生产单克隆抗体。用这种技术生产的单克隆抗体是小鼠单克隆抗体，也称鼠源化单克隆抗体。此类单克隆抗体已被广泛应用于实验室研究、临床疾病诊断和生物分子提纯等方面，创造了巨大的经济效益。

虽然，用杂交瘤技术生产的鼠源化单克隆抗体具有多方面的应用，但它在治疗人类疾病的应用上却受到很大限制。这是因为，鼠源性单克隆抗体对于人体来说是异种蛋白，在应用后会刺激人体产生针对鼠源性单克隆抗体的抗体。这种人抗鼠抗体一方面会加速鼠源性单克隆抗体的清除使之失效，另一方面又会因反复应用可在人体引起超敏反应性疾病。因此，寻找人源化单克隆抗体的生产方法对于生产在人类疾病治疗中有应用价值的人源化单克隆抗体具有重要意义。

目前，主要有两类生产人源化单克隆抗体的技术：一类以杂交瘤技术为基础，另一类以EB病毒转化人B淋巴细胞为基础。第一类技术有两种，一是采用重组DNA技术生产人的单克隆抗体。其具体做法是，用特异性抗原免疫小鼠；取小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞分离得到编码特异性鼠源抗体的cDNA；采用DNA重组技术，用编码人抗体恒定区的cDNA片段置换鼠源抗体的cDNA片段，获得鼠源抗体可变区的cDNA和人源抗体恒定区的cDNA相融合的cDNA；在大肠杆菌、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达人源化单克隆抗体。二是采用人免疫球蛋白基因小鼠产生人单克隆抗体。其具体做法是，采用基因敲除(knock out)和基因敲进(knock in)技术生产含有人免疫球蛋白基因的小鼠，此小鼠的免疫球蛋白基因位点为人免疫球蛋白基因位点。用特异性抗原免疫此含有人免疫球蛋白基因的小鼠，将此小鼠脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合得到产生特异性人源化单克隆抗体的杂交瘤细胞。培养此杂交瘤细胞生产人源化单克隆抗体。

1987年，Goossens等报道，将反复接触同种异体红细胞抗原的人外周血淋巴细胞用EB病毒转化，可获得多个产生人单克隆抗体的永生化B细胞克隆。这些克隆的B淋巴细胞分别产生Ph(D)、Ph(G)、Ph(C)、Ph(E)、Kell、A和Al血型抗原的人单克隆抗体，其浓度平均可达4-50微克/毫升。这些B淋巴细胞克隆细胞在四年内可在体外培养条件下稳定地产生单克隆抗体(Goossens D等，J. Immunol Methods，1987 Aug 3；101(2)：193-200)。1993年，Delneste等从全身性血管炎患者体内分离B淋巴细胞，用EB病毒将其转化；用人内皮细胞系细胞黏附筛选产生人内皮细胞特异性单克隆抗体的转化B细胞克隆，得到产生人内皮细胞表面分子特异性的人单克隆抗体的两个B细胞克隆(Delneste Y等，Cell Immunol.，1993 Aug，150(1)：15-26)。1994年，Buchacher等用EB病毒转化HIV-1阳性志愿者的外周血淋巴细胞，分别得到产生HIV-1包膜蛋白和核心蛋白特异性单克隆抗体的B淋巴细胞株，这些细胞株产生的单克隆抗体具有诊断、研究和治疗HIV-1的价值(Buchacher A等，AIDS Res.Hum Retroviruses，1994 Apr.，10(4)：259-69)。

尽管采用以EB病毒转化B淋巴细胞技术可生产多种人源化单克隆抗体，但该技术存在一个最大的也是显而易见的局限性，即不能根据具体需要，用特定抗原免疫人，然后分离接受免疫者的淋巴细胞并将其用EB病毒转化。本发明提供的技术突破了上述以EB病毒转化B淋巴细胞技术的局限性。