[发明专利]一种快速检测CpG胞嘧啶甲基化的方法

说明书

本发明涉及分子生物学的基因研究领域，具体而言是一种检测胞嘧啶甲基化的方法。

基因表达的甲基化调节已经成为分子生物学研究的热点之一。基因启动子及其附近区域内CpG岛(CpG island)中胞嘧啶甲基化是众多基因实现去表达(沉默)和基因印迹的重要途径。连续表达的看家基因和约40％的组织特异性表达基因的启动子中都存在这种CpG岛。

测定各种防御疾病发生相关基因是否发生了甲基化沉默在后基因组时代将具有重要应用价值。胞嘧啶甲基化的测定方法目前常用的有限制性内切酶法和甲基化特性PCR(MSP)法，很少使用的有测序法。

酶切法的缺点是只能识别位于特异性酶切位点上的CpG胞嘧啶甲基化，例如MspI和HpaII组合识别-C^mCGG-，TaqI识别-T^mCGA-，BstUI识别-^mCG^mCG-，而不能检出非识别位点上的甲基化。

MSP法虽然部分克服了酶切法的缺陷，将多个CpG包含到引物中(特别是3’端)，从而可以检测这些CpG的甲基化状态。但是MSP法的缺陷是：只能识别引物部位CpG甲基化，不能反映扩增片段中非引物配对的广大区域中CpG的甲基化状态。此外，MSP法的引物是以所有与引物配对的模板CpG胞嘧啶均己甲基化为前提设计的，与客观情况存在差别。例如测序研究发现，在hMLH1基因甲基化沉默的6个结肠癌细胞系中，仅仅在其启动子的-248～-178这一区段内的8个CpG胞嘧啶才呈现完全甲基化，附近区域则为部分甲基化。因此，在与引物配对的CpG甲基化程度未知或不完全甲基化的条件下，这样设计出的引物容易出现目标片段难扩增(产率低)，或非特异性条带多(特异性差)，判断难度大等问题，MSP法的这一缺陷大大降低了它的实用性。事实上即使是对专业的分子生物学实验室人员而言，MSP法也是难度较大的方法。

测序法虽然能够精确反映每一个CpG胞嘧啶的甲基化状态，但是其步骤复杂、费用昂贵，即使在科研机构的实验室也极少用来测定CpG胞嘧啶的甲基化，无法推广应用。

本发明的目的在于公开一种将PCR与DHPLC联用，简易、快速检测DNA胞嘧啶甲基化的方法。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。首先将甲基化和非甲基化目标片段转换成解链变性温度不同的2种双链DNA，再运用变性高效液相色谱(DHPLC)能够快速区分这2种DNA片段的原理，建立了一种PCR与DHPLC联用，简易、快速检测DNA胞嘧啶甲基化的新方法，包括下列步骤：

1.用亚硫酸氢钠处理部分待测样品DNA；

2.根据目标片段处理前两端不含CpG的部位，分别设计2对引物。1对能够与处理前的目标片段配对，进行处理前目标片段的PCR扩增(wPCR)；另外1对引物能够与处理后的目标片段配对，进行处理后目标片段的PCR扩增(tPCR)；

3.用DHPLC在未甲基化目标片段的tPCR产物的变性(解链)温度下测定样品tPCR产物的色谱保留时间。如果含CpG岛的目标片段存在多个胞嘧啶甲基化，由于其tPCR产物变性(解链)温度明显高于未甲基化者，在未甲基化者的tPCR产物发生部分变性解链为单链的温度条件下，甲基化者的tPCR产物仍然保持为双链，因而能够被DHPLC轻易区分(保留时间明显延长)；

4.将tPCR产物保留时间明显延长样品目标片段的wPCR产物与野生型对照样品等量混合，进行变性和复性杂交处理，用DHPLC在wPCR产物的部分变性(解链)温度下测定样品目标片段是否存在点突变，以区分tPCR产物保留时间延长是否为核苷酸点突变所致。

附图的简要说明：

图1.在53℃部分变性温度下测定细胞hMLH1基因甲基化的DHPLC

    色谱图

图2.在62℃部分变性温度下测定细胞hMLH1基因点突变DHPLC

    色谱图

本发明的检测CpG岛胞嘧啶甲基化的方法的有益效果在于：

1.能够反映整个目标片段中CpG的胞嘧啶甲基化状态，完全克服了常用的酶切法和MSP法的缺陷；

2.目标片段的PCR扩增效果不再受CpG中的胞嘧啶甲基化状态的影响；

3.成本低廉、速度快捷：费用仅为测序法的十五分之一，时间为测序法的五分之一，却能得到相似的结果。

实施例

1.用酚：氯仿法分别抽提经酶切法证实hMLH1基因已经甲基化沉默的人结肠癌细胞系PKO和未甲基化的胃癌细胞系PACM82细胞DNA；