[发明专利]水蛭素基因hv2－47k及其合成与表达

说明书

本发明涉及一种重组药物，特别是水蛭素基因及其合成与表达。

水蛭素(Hirudin)最早是从日本医蛭(Hirudomedicinalis)唾液腺中分离得到的一类多肽。之后，研究者从各种嗜血水蛭中分离得到的水蛭素变异体不下于20种，它们大都是由60多个(64-69个不等)氨基酸残基组成，其中研究应用最多的是由65或66个氨基酸组成的三种变异体(HirudinVariants)，分别称为HV1、HV2和HV3，所有天然水蛭素C-端第63位酪氨酸Tyr(Y)均硫酸酯化(RobertHand，et al Transgenica-Topics in Clinical Biotechnology http：//pharminfo.com/pubs/transgen/th-hir.html)。

水蛭素对人及其他哺乳动物的凝血酶均有很高的亲和力，是迄今发现的最强的凝血酶天然抑制剂。它是通过同凝血酶的催化中心及纤维蛋白原结合中心发生不可逆的结合，使凝血酶失活。一分子的水蛭素与一分子的凝血酶形成牢固的、非共价的复合物，因此，失活的凝血酶基本上是不可逆的，这就使纤维蛋白原的转化及凝血酶介导的血小板的激活过程被阻断。

水蛭素的N-端(1～39)主要含有疏水性氨基酸，通过三个链内二硫键来稳定，而C-端(40～65)富含酸性的氨基酸，其中C-端的10个氨基酸残基组成的肽段，是特异性结合凝血酶并使之失活的关键区域。对HV1和HV3的47位赖氨酸(K)残基研究发现，K对水蛭素的活性及其同凝血酶的相互作用也很重要(Mao，S.J.T.，etal.，Anal.Biochem.161：514-518，1987；Harvey，R.P.，etal.，PNAS(USA)83：1084-1088，1986；Dodt，J.，etal.，FEBSLett.2 29：87-90，1988)。HV2的47位赖氨酸可能通过氢键和静电相互作用同时影响水蛭素的三维结构以及其同凝血酶的结合，使其热稳定性增加，生物活性提高61％(鹿峪峰等中国生物化学与分子生物学学报，1998；14(1)：32-37)

鉴于天然水蛭素来源有限，80年代后期，国内外都开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素，以满足药理及临床研究试验的需要。目前国外从事水蛭素基因工程研究开发的公司不下于11家。其中德国Hoechst公司将HV2的N端第一位的异亮氨酸(I)变为亮氨酸(L)，生产的第二63位酪氨酸Tyr脱硫水蛭素Lepirudin(化学名：Leu1，Thr2-63-desulfohirudin，商品名REFLUDAN)，其粉针剂已于1998年先后在欧洲和美国上市，用于治疗肝素诱发的血小板减少症(HIT，Heparin-induced thrombocytopenia)。瑞士的Ciba-Geigy(NOVARTIS)公司采用重组技术在啤酒酵母中表达的第63位脱硫水蛭素，命名为Desirudin，商品名Revasc，主要用于骨科手术及其他大手术后的并发症，如深部静脉血栓(DVT，Deep vein thrombo-sis)及肺栓塞(PE，Pulmonary embo lism)，现已经在欧洲上市(Aventis-Refludan Prescribing Information http：//www.Aventispharma-s.com/Pis/refludan-TXT.html)。

经过综合分析后，我以HV2的氨基酸序列为主体，同时参考HV1、HV3的序列，将HV2的47位的天冬酰胺(N)取代为赖氨酸(K)，选用甲醇酵母Pichia pastoris所喜好的遗传密码子，人工合成8段寡核苷酸链(引物)(链长31-46碱基不等)，采用递归式PCR(Recursive PCR)(毕群，黄仪秀，朱圣庚水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌北京大学学报(自然科学版)33(6)：737-742，1997)，拼接新型水蛭素hv2-47K该基因将之插入到Pichia酵母分泌型表达载体pPIC9中，构建表达载体PIC8.2。用此载体转化Pichia酵母，获得高效表达的工程菌。本发明的主要内容是：1.hv2-47k基因的合成