[发明专利]一种质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用

说明书

本发明涉及一种质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用，属艾滋病防治领域。

艾滋病(AIDS)是由I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的破坏机体免疫系统的致死疾病。自1985年我国发现首例艾滋病人以来，该病在全国迅速蔓延，现已进入高速增长期，艾滋病的防治已成为关系到国计民生的大事。艾滋病的临床治疗，及抗艾滋病新药和疫苗的发现与研究，需要一客观、可靠的指标来评判HIV感染者的病程和预后。已有的血清p24抗原水平检测、逆转录酶活性测定、病毒分离培养等方法也能在一定程度上反映患者体内病毒数量的变化，但以上方法干扰因素多，费时费力且灵敏度较低。大量研究表明，HIV-1病毒载量的变化是HIV-1感染者病程和预后判断的最客观依据，已商品化的定量检测HIV-1的技术有：聚合酶链反应(PCR)(Amplicor HIV-1Monitor test；Roche)、NASBA和b-DNA。Roche公司的Amplicor Monitor test(PCR)是FDA批准的唯一用于临床检测HIV-1的试剂盒。该检测试剂盒价格十分昂贵(每个样品的检测费用在200至500美元之间)，技术要求高。现有的方法有的只能在极少数实验室开展，因此难以广泛应用于临床和科学研究。

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种操作简单，价格便宜，特异性好，灵敏度高，同时有较好的可重复性的质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用。

本发明是这样实现的：质粒为pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486。

pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486的构建方法，是将8E5细胞含有的单拷贝HIV-1前病毒DNA进行Sal I/Sac I双酶切，与被同样双酶切的购自Promega公司的pSP64Poly(A)质粒发生粘性末端连接，得到含有HIV-1gag基因片断的pSPgag737重组质粒，转化至JM109感受态细胞，经酶切/PCR鉴定，得到阳性克隆子。体外转录阳性克隆子，获得病毒载量定量测定的RNA外参照。

pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486在艾滋病毒载量测定上的应用：应用 1、2的外参照，将聚合酶链反应技术与柯达电泳图谱分析系统相结合，建立测定HIV-1感染者和艾滋病人血浆的病毒载量定量测定的方法。

附图1为pSPgag737质粒的构建。

附图2为带酶切位点的GAG1/GAG2为引物的聚合酶链反应(PCR)扩增结果

附图2中1：扩增产物(8E5细胞DNA为模板)；2：DL2000分子量标准。

附图3为重组质粒的酶切电泳分析图谱。

附图3中1：λDNA/EcoRI+Hind III分子质量标准；2：重组质粒；3：重组质粒经EcoRI酶切；4：重组质粒经BamHI酶切。

附图4是重组质粒为模板的PCR扩增结果。

附图4中1：DL2000分子质量标准；2：引物sk38/sk39的PCR扩增产物(115bp)；3：引物sk145/sk431的PCR扩增产物(142bp)；4：引物GAG1/GAG2的PCR扩增产物(721bp)。

附图5为病毒载量测定PCR扩增结果。

附图5中1：pGEM-7zf/HeaIII分子质量标准；2：阳性对照；3：阴性对照；4～9：十倍稀释的外参照6个梯度(1-10⁵)；10：病人A的含HIV-1样品；11：病人B的含HIV-1 RNA样品；12：健康人血浆样品。

附图6为外参照工作曲线。

附图6中其线性系数为0.96，其回归方程为Y(Mass)＝25.46X(Log Inputcopies)+18.13

以下结合附图对本发明的技术方案作进一步详述：

该质粒为pSPgag737 CGMCC NO.0486。该质粒鉴定为pSPgag737的理由是它的基因组内插入了HIV-1gag基因片断。其分类性质为含有SP6 RNA聚合酶启动子和(dA：dT)₃₀的质粒。作为判断基准的有关文献是GenBank/EMBL Accession Number：X65328。

1. pSPgag737质粒的构建