[发明专利]有效用作标记试剂的基于若丹明的荧光团

说明书

广言之，本发明涉及标记用于荧光侦测之有机化合物之方法。更为特别地，本发明涉及基于若丹明(Rhodamine)的荧光团，其可经由与有机分子进行衍生而变得有用，并可应用于标记生物分子，例如合成寡核苷酸和蛋白质。荧光团为单一异构体、稳定并在标准亚磷酸盐化学中具有活性，且其缀合物保有荧光。

荧光染料具有作为侦测标记之用途早已发现而广泛应用于分子生物学、细胞生物学以及分子遗传学中。特别是，将荧光标记之寡核苷酸用途扩展至DNA测序、荧光原位杂交(FISH)、杂交分析，包括核酸列阵(“DNA芯片”)、探针俘获分析、荧光极性研究、以及DNA扩增分析：聚合酶链反应(PCR)、等温扩增分析(链置换扩增(SDA))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自动维持序列扩增(3SR)、并扩展至荧光引物及/或探针检测(“Taqman”分析)。

目前自动化DNA测序方法系使用多重荧光标记，对单一凝胶泳道或毛细管中之碱基序列并行检测。大部分通用于测序之荧光染料系经制成异构体，包括若丹明家族者之混合物。(关于若丹明染料，使用染料化学学会，第2版，1971，颜色指标所述之编号体系)。单一异构体染料标记对高解析技术，例如DNA定位和毛细电泳优选，因为荧光团中不同异构体形式之间，在光谱性质中存有些微的差异。此外，若使用异构体混合物时，经荧光团标记之5-和6-异构体引物(例如5-和6-羧基四甲基若丹明)可导致条带加宽(亨格等人，分析生物化学，238，165-170，1996)。因此，在制备用于DNA测序之标记寡核苷酸的荧光染料标记试剂之前，必须先将单一异构体形式纯化出。

在合成引物(例如使用荧光素亚磷酰胺试剂之荧光素)过程期间，部分的荧光染料标记可附着至寡核苷酸之5’端。此等染料亚磷酰胺在亚磷酸盐化学条件下可适当地反应，因为在荧光素的部分上两个活性氧基团受到保护，可防止亚磷酰胺与荧光素间可能的副反应。此外，以保护基修饰使3-位置羧酸官能基保持在封闭环之内酯形式中，以避免质子从羧酸酯供给至N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺。质子化可将二异丙基氨基的部分转化成良好的脱离基，其可分解成该试剂。一部分合成的若丹明亚磷酰胺(例如美国专利案号5,231,191，1993年7月27日获准，发明者吴等人)具有3-位置羧酸官能基，其系处于封闭(内酯)与开放(酸)形式间的平衡。当该试剂使用在寡核苷酸合成中时，“酸性”环境将有利于羧酸盐—鎓阳离子形式的形成。从羧酸的部分将质子供给至N，N-二异丙基氨基亚磷酰胺可发生，并导致试剂的不稳定，折抵寡核苷酸标记的效率。

在目前实用标准方法中，将经标记寡核苷酸从固相支持物断裂出并以浓的水性氨将保护基移除期间，部分的荧光染料标记(例如荧光素及相关衍生物)可保留其荧光性质。然而若丹明家族中的染料容易受到氨处理的修饰，显著地降低其荧光性质。因此，一般的操作是在自动化合成、裂解和去质子化后，将若丹明型式染料附着至业已经连接子官能性(例如伯胺)修饰之寡核苷酸之5’端。在经5’-若丹明染料标记之寡核苷酸总合成中，此染料标记需要另外的步骤和手工劳动，招致较大的花费和不便。

于本发明之一方面中，致荧光化合物及组合物是以若丹明为基础。于若丹明中，3-位置有羧酸酯。本发明之致荧光化合物，或荧光团中，3-位置之羧酸可转化成完全取代的酰胺。酰胺氮上的取代基为一可有效阻断内酰胺环形成的基团。酰胺氮上之另一取代基则为有用于制作、或包括所需之衍生物。此等有用之荧光团衍生物有助于标记有机化合物以进行荧光检测。优选之有机化合物为生物分子，例如肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、或核酸聚合物。当合成标记寡核苷酸时，缀合作用优选是经由亚磷酰胺键结进行，且在合成标记肽类或作标记时，其可经由各种的已知蛋白质缀合化学来进行。

下式A说明本发明的基于若丹明的荧光团的部分，其中R_a和R_a’二者为酰胺氮上之非氢取代基。

                    式A