[发明专利]编码pfk基因的新核苷酸序列

说明书

本发明提供了编码pfk基因的核苷酸序列，和通过具有增强的pfk基因的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。

氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其是通过扩增各个生物合成基因并研究对氨基酸生产的作用而进行。这一主题的综述文章可在Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6：261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技术学关键综述15，73-103(1995))和Sahm等(纽约科学学会年报782，25-39(1996))。

本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。

氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。

当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。

本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：

a)与编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，    

b)编码包括与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及

d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。

本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选包括能复制的DNA，包括

(ⅰ)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或

(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，

(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。

本发明还提供了

权利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

权利要求6的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，

包括权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是穿梭载体或质粒载体，

以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。

本发明还提供了基本上包括多核苷酸序列的多核苷酸，其可通过用包括相应于SEQ ID NO：1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO：1的所述多核苷酸序列的完整基因。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码果糖磷酸激酶的全长cDNA，以及分离与果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。

本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。

作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有果糖磷酸激酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO：2的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。