[发明专利]一种高效亲和色谱填料及其制备方法

说明书

本发明涉及一种高效亲和色谱填料及其制备方法，具体涉及以肝素为配基的高效亲和色谱填料及其制备方法。

按亲和填料的基质又可分为软胶和硬胶两种类型。软胶包括天然多糖和聚丙烯酰胺等，它们具有良好的亲水性，对蛋白质的非特异性吸附低，在低压操作下，具有优良的色谱分离性能，但它们的机械强度差，凝胶颗粒极易变形而破坏，使操作压力和流速均受到很大限制，且使用寿命也短。大孔硅胶是被广泛使用的硬胶，它们具有很好的机械性能，可在高压、高流速条件下使用，但它们的化学稳定性差，仅在pH2～8条件下使用。另外，硅胶表面的带负电荷的硅羟基，对蛋白质有较强的非特异性吸附，使得回收率大大降低，因而也很难用于实用的高效亲和色谱。理想的高效亲和色谱填料应具有较高的机械强度，较好的化学稳定性，良好的亲水性和生物相容性以及较长的使用寿命。

以肝素为配基的亲和填料是一种用途广泛的特种生化分离材料。以肝素为配基的亲和填料有肝素-Sepharose，肝素-聚丙烯酰胺和肝素-硅胶等。

在与本发明相关的工作中，F.L.Zhuo等曾报道了一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料[Journal ofChromatography，476(1989)，195-203]，他们是将DEAE-agrose包覆在大孔硅胶的表面，再将肝素键合在包覆层上，制备了以肝素为配基的高效亲和色谱填料。经色谱表征，该材料对抗凝血酶III有较强的亲和作用，但在硅胶表面包覆天然多糖后，并不能完全屏蔽硅胶表面的硅羟基，对蛋白质仍存在较强的非特异性吸附，质量回收率仅为78％。

本发明的目的在于提供了一种以肝素为配基的高效亲和色谱填料，克服了已有技术中以肝素为配基的高效亲和色谱填料蛋白质回收率低的缺点。

本发明的另一个目的在于提供该填料的制备方法。

本发明的高效亲和色谱填料，以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为基质，在该填料中含有下式的聚合单元：其中P的结构为：Hep为肝素，其结构为：

上述的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球是甲基丙烯酸环氧丙酯和甲基丙烯酸乙二醇双酯的共聚物。

本发明的高效亲和色谱填料的制备，采用如下三种方法：

1)先用盐酸对肝素进行处理，然后再利用肝素分子中的氨基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的环氧基偶联，得到本发明的填料，其中肝素处理步骤包括将肝素溶于0.1M盐酸中，加热，然后加入到乙醇中。

2)先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺存在下，利用肝素分子中的羧基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的氨基反应，得到本发明的填料。

3)先将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球进行氨基化，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，然后再将所述氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球与肝素在氰基硼氢化钠存在下进行还原氨化反应，利用肝素分子还原端的醛基与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球上的氨基反应得到本发明的填料。方法一：方法二：方法三：

本发明的高效亲和色谱填料的3种制备方法具体步骤如下：方法一：

1.将肝素钠溶于0.1M HCl中，浓度为1％-20％(w/V)，置于沸水浴中加热10-60min。

2.将上述溶液加入到乙醇中，有大量白色沉淀生成，乙醇的体积是上述溶液的1-10倍。

3.过滤，将滤渣于30-80℃温度下干燥至干。

4.将上述干燥后产物溶于0.3-1.0mol/L的Na₂CO₃溶液中，溶液浓度为0.5％-10％(w/V)，再加入聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，肝素与聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的重量比为30∶1-3∶1，较佳的为20∶1-5∶1，搅拌，在40-80℃反应24-96h。

5.过滤，将滤渣于30-80℃温度下干燥至干。方法二：

1.制备氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入氨水中，二者的重量体积比为1∶6-1∶2，搅拌，在30-60℃保温5-10h后，得到氨基化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球。