[发明专利]单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺

说明书

神经节苷脂是一族异构的含唾液酸残基的结构复杂的膜糖脂，其分子皆由一个疏水的神经酰胺部分和一个亲水的唾液酸寡糖基团组成。神经酰胺由鞘氨醇的氨基与脂肪酸酸化而成。神经节苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性。Sevennerholm按唾液酸残基的位置和寡糖核心区的长度，将神经节苷脂分为不同的种类，其中GM1为单唾液酸四已糖神经节苷脂。

哺乳动物中枢神经系统中神经节苷脂含量丰富，其中以神经系统灰质含量最高。据估计，以水解后的唾液酸计算大脑中每克新鲜灰质和白质含量分别为3000-3500nM和1000-1250nM，明显高于其他组织。中枢神经系统的神经节苷脂主要为神经节系列，大脑灰质多为GM1，GD1a，GD1b，(GD为二唾液酸神经节苷脂)GT1b(GT为三唾液酸神经节苷脂)，GQ1b(GQ为四唾液酸神经节苷脂)，其次是GM2和GD3；白质以GM1和GM4为主。神经节苷脂在神经元胞体中含量略低于平均水平，而在突触小体中含量高于平均水平。对于单个神经节苷脂而言，GT1，GD1b及GM1集中于突触前后膜。神经节苷脂位于神经元细胞膜双层结构外层，神经酰胺一端嵌入细胞膜内，而寡糖链一端伸出细胞膜外突入外环境。神经节苷脂的这种非对称性分布以及它们的化学性质差异使其特别易与各种细胞外信息发生相互反应，从而在细胞膜活动上充当重要角色。实验证明外源性神经节苷脂尤其是GM1能嵌入神经细胞膜，模仿内源性神经节苷脂的某些功能，调节膜介导的细胞功能，并能刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制阻止损害的发展，保护未受损的神经组织，同时还能影响体外培养的神经元的生长及其活性，促进其存活及生长。神经节苷脂GM1在神经系统中的主要生理作用为1，促进神经细胞的生长，分化发育和神经再生2，参与突触传递，维持脑的正常机能，参与各种学习记忆活动3，在细胞与细胞，细胞与微生物以及细胞与基质间的相互作用过程中起介导作用4，调节细胞膜中各种蛋白质功能，如离子通道，表皮生长因子受体等。由意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我国销售。由于GM1能通过血脑屏障，注射后快速在大脑和脊髓组织中分散，因此临床上GM1的治疗效果十分显著。主要用于治疗人血管性或创伤性中枢神经系统损伤。如脑卒中、急性脊髓损伤和脑外伤。

CM1的研究已有数十年，目前已证明其结构组成和理化性质，主要归结为：

1.GM1分子由一个唾液酸，一个葡萄糖，二个半乳糖，一个氨基半乳糖及一个神经酰胺残基组成。分子式为：

2，分子量：1551，钠盐为1574

3，性状：为乳白色粉末，无味，有吸湿性，溶于水，甲醇-水及甲醇-氯仿溶液。不溶于甲醇，丙酮，氯仿，乙醚。熔点：207-230摄氏度。

4，紫外吸收最大波长位于205nm有特殊的红外吸收光谱，可通过氨基正相柱高效液相色和薄层色谱(TLC)进行纯度鉴定。气相色谱可鉴定GM1分子中糖基和神经酰胺残基。

神经节苷脂及GM1提取和分离纯化已有文献和专利报道。其主要提取方法是：猪脑或牛脑经绞粹，用丙酮脱水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有机溶剂提取[Svennerholm.et al Biochemical et Biophsica Acta，617-109(1980)]。提取物神经节苷脂转入水相[J.Folch，The Journal of Biological Chemistry，226，497-509(1957)].用DEAE-Sephadex-A25纯化[R.w.Ledeen，et al.Journal ofNeurochemistry，21，829(1973)].硅胶层析，GM1得率达到14％。神经节苷脂的分离有用a环糊精技术(EP00469352A1)，也用大孔径树脂吸附技术(CN85102590)。神经节苷脂脱唾液酸方法有用唾液酸酶处理法(Richard Kuhn，etal.，ChemischeBerichte，1963.96.866).有用加热处理法(US4868292)以及微生物处理方法(FukanoY，et al.，Appl Environ Microbiol，1997.63.1861)。GM1纯化方法Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。亲和层析技术(Krishna Kant，et al J.Chromato，1989.494：289)等。