[发明专利]甘露糖的定量测定方法及其试剂

说明书

本发明涉及用酶学方法精确和方便地定量测定甘露糖的方法及定量测定用试剂。

甘露糖是己糖型的，微量存在于人血。作为供应途径，已知主要通过葡萄糖代谢系统供应甘露糖，而不是通过食物的摄入。甘露糖的血浓度通常低至约0.5mg/dl。但是，已知在患者罹患糖尿病时该浓度有高的倾向，这些患者缺乏控制血糖(Clinca.Chimica Acta 251；1996 pp 91-103)或真菌感染(J.Clin.Microbiol.21(6)；1985 pp 972-979)的能力，有人提议甘露糖浓度对于这些疾病的诊断有用。

测定甘露糖的方法已知有气相色谱法(Clin.Chem.25；1979；pp 1384-1387)、液相色谱法(Bulletin of Japan Urology Association，80；1989；pp1816-1823)酶学方法(Clin.Chem.30(2)；1984 pp 293-294)等。

例如，在酶学方法中，因为如果样本或样品中含有葡萄糖则难以进行精确测定，所以必须消除葡萄糖。在Soyama等的方法(Clin.Chem.30；1984 pp 293-294)中，先用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶消除样本中的葡萄糖。然后，在三磷酸腺苷(下文称作ATP)存在下，将甘露糖与己糖激酶反应，将其转化为甘露糖-6-磷酸，再与甘露糖-6-磷酸异构酶反应转化为6-磷酸果糖，进一步与葡糖-6-磷酸异构酶反应，将其转化为葡糖-6-磷酸，最后，在辅酶氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文称作NAD)存在下，与葡糖-6-磷酸脱氢酶反应，然后，用分光光度计测定所形成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文称作NADH)的吸光度(340nm)以定量测定甘露糖。

作为上述酶学方法的改进，Pitkanen等报告了一种定量测定甘露糖的方法(Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem 35(10)；1997 pp761-766)，其中，在ATP和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文称作NADP)存在下，将己糖激酶和葡糖-6-磷酸异构酶与同时存在葡萄糖和果糖的样本反应，从而将葡萄糖和果糖转化为葡糖-6-磷酸；再加入葡糖-6-磷酸脱氢酶将葡糖-6-磷酸转化为葡糖酸内酯-6-磷酸；所形成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文称作NADPH)用盐酸在酸性条件下降解以消除葡萄糖等的影响；然后以上述同样的方法，在ATP和NADP存在下，将甘露糖与己糖激酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、葡糖6-磷酸异构酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶反应，测定所形成的NADPH的吸光度(340nm)。

但是，在上述酶学方法中，由于需要处理复杂的酶接合系统，其中各种酶促反应结合在一起，因此难以使所有酶处于最适条件。而且，由于各种昂贵的酶结合在一起使用，因此在成本方面有问题。此外，还有一个缺点，即这些方法对来自生物样本或杂质的成分的影响敏感。

另一方面，在气相色谱法和液相色谱法中，必须进行麻烦的操作，如衍生化或诸如荧光之类标记，及使用特殊仪器，因此这些方法不适合于处理大量样本。

本发明的一个目的是提供定量测定甘露糖的方法及定量测定用试剂。用它们可进行大量样本的精确和方便的处理。

为了完成上述目的，一方面，本发明提供定量测定甘露糖的方法，包括在电子接受体存在下将样本中的甘露糖与能通过脱氢反应氧化甘露糖的酶进行反应，并定量测定所形成的电子接受体还原物。

上述方法中，当样本除甘露糖外还含有葡萄糖时，较佳为在与酶反应前用葡萄糖消除剂将样本中的葡萄糖转化为不与酶反应的结构。

上述方法中，酶较佳为属于酶编号EC类1.1.1.119的葡萄糖脱氢酶，更佳为来自属于葡糖杆菌属的微生物的己醛糖脱氢酶。作为样本，较佳为选自血液、血清、血浆、脑脊液和尿液的至少一种生物样本，或从所述生物样本制得的样本。

另一方面，本发明提供定量测定用试剂，包括在电子接受体存在下能通过脱氢反应氧化甘露糖的酶，及对酶有用的电子接受体。

该试剂较佳还包含葡萄糖消除剂。此外，酶较佳为属于酶编号EC类1.1.1.119的葡萄糖脱氢酶，更佳为来自属于葡糖杆菌属的微生物的己醛糖脱氢酶。此外，葡萄糖消除剂较佳为包含葡萄糖6-位磷酸化酶和腺苷三磷酸。且电子接受体为辅酶NADP。

按照本发明，由于酶直接与甘露糖反应，并能通过脱氢反应氧化甘露糖，无需通过复杂的酶接合系统进行测定，因此能方便地定量测定葡萄糖及进行大量样本的处理。而且，使用葡萄糖消除剂时，测定几乎不受样本中葡萄糖的影响，因此能精确地定量测定甘露糖。