[发明专利]发酵生产L－氨基酸的方法

说明书

本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，尤其涉及一种使用属于埃希氏杆菌属的细菌生产L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。

传统上，L-氨基酸(如L-苏氨酸和L-谷氨酸)主要是采用属于短杆菌属、棒状杆菌属和微杆菌属的棒形细菌或其突变体通过发酵方法进行生产(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan Center,195-215页，1986)。

另外，已经公开了采用基因重组技术培育生产L-氨基酸的埃希氏杆菌属细菌的技术。

例如，已经公开了一种采用大肠杆菌生产L-赖氨酸的方法，其中大肠杆菌中编码二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶的基因被脱敏而对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制不敏感，并且二氨基庚二酸脱氢酶(或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶)被增强(95/16042)。

尽管L-氨基酸的产生能力通过培育上述的微生物得到很大的提高或生产方法被改进，但仍然希望研究出生产L-氨基酸更有效的方法以便满足将来对氨基酸的大量需要。

丙酮酸羧化酶[丙酮酸:二氧化碳连接酶(形成ADP),EC6.4.1.1]是一种含生物素的酶。它催化丙酮酸形成草酰乙酸的羧化反应。还不知道大肠杆菌中是否有丙酮酸羧化酶，但枯草芽胞杆菌(Diesterhaft,MD.和Freese,E.,J.，生物化学，248,No.176062-6070(1973))和谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物学，144,915-927(1998))具有丙酮酸羧化酶，并且编码酶的基因的核苷序列已被报导过。

而且，已知丙酮酸羧化酶的活性被增强了的谷氨酸棒状杆菌或丙酮酸羧化酶基因被灭活了的谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物学，144,915-927(1998))。然而，构创建这些微生物是为了作为实验材料来研究利用葡萄糖生长所必需的酶。还不知道丙酮酸羧化酶活性与L-氨基酸产生能力的关系。也不知道将丙酮酸羧化酶基因引入埃希氏杆菌属的细菌中的意图。

本发明根据前述观点得以完成，其目的是提供一种高效生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。

为了达到上述目的，进行了辛勤的研究，结果本发明的发明人发现将编码丙酮酸羧化酶的基因(下文定义为“pyc基因”)引入埃希氏杆菌属的细菌中能够提高细菌生产L-氨基酸的产生能力。因此本发明得以完成。

即，本发明涉及被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了并且具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌。

本发明也提供了含有源自于芽胞杆菌属细菌的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。

本发明进一步提供了引入了低拷贝数的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。

本发明还进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述细菌。

本发明也提供了包括在培养基中培养上述细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸的L-氨基酸生产方法。

本发明进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述方法。

术语“L-氨基酸产生能力”是指所述细菌比其野生型菌株在培养基中更多地生产和积累L-氨基酸的特性。

根据本发明，L-氨基酸，如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的产生能力在埃希氏杆菌属的细菌中能得到提高。并且，本发明可被用来培育属于埃希氏杆菌属的L-氨基酸产生菌。

图1表示为克隆pycA基因构建枯草芽胞杆菌pyc::KmR受体菌株的方案；

图2表示自枯草芽胞杆菌168克隆pycA基因的方案；

图3表示含有pycA基因的质粒的构建方案。

下面详述本发明。

<1>用pyc基因转化的埃希氏杆菌属的细菌