[发明专利]在转基因植物中表达多种蛋白的方法

说明书

本申请是申请日为1995年3月9日，申请号为95192047.2，发明名称为“得自楤木属和凤仙花属的抗微生物蛋白”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及抗微生物蛋白，它们的加工过程和应用，以及编码它们的DNA序列。特别涉及能从楤木属(Aralia)和凤仙花属(Impatiens)的种子分离的抗微生物蛋白。

在本文中，抗微生物蛋白定义为具有至少下列一种活性的蛋白或肽：抗真菌活性(可包括抗酵母菌活性)，抗细菌活性。活性包括一系列的对抗效应如部分抑制或死亡。抗微生物蛋白可为低聚物或可为单肽单位。

楤木属是五茄科的一部分，该科为一中等大小的植物家族，其中最著名的成员是常春藤和人参。一些药物提取物已从一些楤木属的种如土当归中取得。

凤仙花属是凤仙花科植物家族中的一部分。共有500～600凤仙花属物种，其中很多作为温室或盆栽植物被商业栽培。

植物产生很多种抗真菌化合物以对抗潜在的入侵者，并且在最近10年已明确具有抗真菌活性的蛋白形成这些防御的重要部分。几类这样的蛋白已被描述，包括：thionins,β-1,3-葡聚糖酶，核糖体钝化蛋白，zeamatins，几丁质结合植物凝血素和几丁质酶，这些蛋白已得到相当的注意，因这它们可潜在地用作生物防治剂。

具有抗植物致病真菌活化的抗微生物蛋白已从某些植物物种分离。我们以前已描述过数种这样的蛋白的结构和抗真菌特性，包括：

得自紫茉莉(Mirabilis jalapa)种子的Mj-AMP 1和Mj-AMP2(Cammue BPA等，1992,J Biol Chem,267∶2228-2233；国际申请公开(International Application Publication)第WO 92/15691号)；

得自尾穗苋(Amaranthus caudatus)的Ac-AMP 1和Ac-AMP2(Broekaert WF等，1992,Biochemistry,37∶4308-4314；国际申请公开第WO 92/21699号)；

得自辣椒(Capsicum annuum)的Ca-AMP 1，得自大凌风草(Briza maxima)的Bm-AMP 1，得自飞燕草属(Delphinium)的Da-AFP，得自Catapodium的Cr-AFP，得自野靛属(Baptisia)的Ba-AFP和得自Microsensis的M1-AFP(国际专利申请公开第WO 94/11511号)；

得自萝卜(Raphanus sativus)种子的Rs-AFP 1和Rs-AFP 2(Tevras FRG等，1992,J Biol Chem,267∶15301-13309)和相关蛋白如得自蔓菁(Brassica napus)的Bn-AFP 1和Bn-AFP 2，得自芜菁(Brassica rapa)的Br-AFP 1和Br-AFP 2，得自欧白芥(Sinapis alba)的Sa-AFP 1和Sa-AFP 2，得自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的AT-AFP 1，得自光滑大丽花(Dahlia merkii)的Dm-AMP 1和Dm-AMP 2，得自蓟属benedictus的Cb-AMP 1和Cb-AMP 2，得自扁荚山黧豆(Lathyrus cicera)的Lc-AMP，得自蝶豆(Clitoria ternatea)的Ct-AMP 1和Ct-AMP 2，得自萝卜的Rs-nsLTP(国际专利申请公开第WO 93/05153号)。

这些和其它植物衍生的抗微生物蛋白作为杀真菌剂或抗生素是有用途的，特别是用于农业目的。这些蛋白可应用在植物上或周围或可在植物内表达。

我们现已提纯了新的强有力的抗微生物蛋白。

按照本发明，提供了一种约3KDa的抗微生物蛋白，可从楤木属或凤仙花属的种子分离。

我们已从楤木的种子提纯了两种新的抗微生物蛋白，在下文中称为Arc-AMP 1(楤木-抗微生物蛋白1)和Arc-AMP 2(楤木-抗微生物蛋白2)。

我们还已从凤仙花的种子提纯了4种新的抗微生物蛋白，在下文中称为Ib-AMP 1(凤仙花-抗微生物蛋白1),Ib-AMP 2(凤仙花-抗微生物蛋白2),Ib-AMP 3(凤仙花-抗微生物蛋白3)和Ib-AMP 4(凤仙花-抗微生物蛋白4)。

根据本发明的抗微生物蛋白可从楤木属或凤仙花属的种子分离，也可从相关或不相关的物种的种子分离，或还可通过任何适当的方法产生或合成。