[发明专利]在高pH下蛋白质的回收

说明书

发明领域：

本发明涉及一种从培养液中回收糖苷酶或者肽酶的方法，所述酶在该培养液中是从不溶状态到溶解状态。

背景技术：

由于显著量的目标蛋白不是处于溶解状态，可能会阻碍从培养液中回收该蛋白。

该问题可能发生在如下情况中，比如当目标蛋白结合在沉积物的成分上，同样地或者由于显著量的目标蛋白在从培养液中回收前已经沉淀或结晶。

目标蛋白与沉积物的结合是指该蛋白结合在培养基中的固形物上，比如细胞类的固形物或培养基中的其他固体成分。

在蛋白质的有效回收上，这是一个重要问题。

已经有几种方法可以解决或者减小该问题。

在许多情况下，低或不稳定的回收率被接受，其他情况下通过添加如下物质可消除这个问题，比如离子型或非离子型表面活性剂，盐类，消/去泡剂，醇类，目标酶的底物或其类似物。

在许多情况下这些技术是低效的，其他情况下，采取了复杂的步骤(如液-液分离系统)，这需要添加大量的(可能不只一种的)试剂。

在脂肪酶类的回收上可以找到这样的一些例子，脂肪酶很容易附着在发酵液中的固形物和/或在回收中可能用到的助滤剂上。

WO 97/23604描述了一种从发酵液中回收脂肪酶的方法。

所述方法的必要步骤包括非离子表面活性剂和醇的使用，这样得到的终产物含有微生物蛋白(优选脂肪酶)，所述非离子表面活性剂和所述醇。参见WO 97/23604的权利要求1。

EP 0574050A1描述了一种方法，用于从发酵液中回收疏水性产物，优选脂解酶(参见第3栏，47-50行)。该方法的必要步骤包括非离子表面活性剂和盐的一同使用。参见例如权利要求1。

生物技术杂志(Journal of biotechnology)，26(1992)111-142是一篇综述性文章，文章记述了关于脂肪酶不同纯化策略的现有技术。在129页提到脂肪酶的纯化通常受其溶解性问题的阻碍。该文章总结了现有技术对此问题的解决方案，其中包含着非常复杂的纯化策略，比如液-液提取，双水相提取，特异性膜加工和免疫纯化。

对于在回收发酵液前蛋白质出现沉淀或结晶，至今没有真正有效的方法。通常尝试使用大量的助溶剂(如尿素)。其他例子中采取了固-固分离技术，其中该沉淀或结晶的目标蛋白与发酵液中其他固体分离—这些分离经常是不可能的并且总是复杂的。

发明概述：

本发明要解决的问题是提供一个简单而有效的方法，用于从培养液中回收糖苷酶或者肽酶，其中显著量的目标糖苷酶或肽酶在培养液中不是处于溶解状态。

发明人的解决方案是：培养液中所含显著量的目标糖苷酶或肽酶因pH在7.5而没有处于溶解状态时，通过使用极端pH条件，即pH9.5～13，目标蛋白可以得到有效的回收。

因此，本发明涉及从培养溶液回收目标糖苷酶或肽酶的方法，该培养溶液含有可产生目标糖苷酶或肽酶的细胞，并且在pH7.5下，其中少于80％的目标糖苷酶或肽酶在该培养溶液中处于溶解状态，该方法包括：

a)通过调节该培养液的pH到9.5～13，使目标糖苷酶或肽酶溶解；并且

b)将细胞与溶解了的产物相分离，得到含有目标糖苷酶或肽酶的溶液。

所述“培养液”在此指包含目标蛋白和产生该目标蛋白的细胞的溶液。该培养液可能含有其他任何成分，尤其是通常被用于细胞发酵的成分。按照本发明，培养液将优先指发酵培养液。

所述“培养液在pH7.5下，其中少于80％的目标糖苷酶或肽酶处于溶解状态”指本文要解决的主要问题，即当显著量的目标蛋白为不溶状态时回收该目标蛋白。

“培养液”是否符合此标准可由如下事实确定，培养液的上清液中目标蛋白浓度低于该培养溶液中目标蛋白总浓度的80％。上清液是水相培养液，可通过例如，在足以去除细胞的条件下离心而得到。

所述浓度指每一升中蛋白的量(干重)(如g/L)，或者是每一升中的蛋白活性。

所述“在pH7.5下”在此指上清液从pH7.5的培养溶液中分离(优选离心)得到。

上清液和培养液中的目标蛋白浓度可以随后在此pH7.5或另一pH下测定。

这取决于目标蛋白和培养液的特性，可以由技术人员的常识决定(可参见下面对此的进一步讨论)。

可以选择另一种表示为：

“培养液”符合本文标准的前提是：

Prot._Conc.sup./Prot._Conc.Cul-sol×100＜80，pH7.5；其中