[发明专利]使用不同的核苷酸混合物的DNA测序方法和用于该方法的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及采用双脱氧核苷酸介导的链终止反应的DNA核苷酸序列分析方法，更具体地讲，涉及通过一步分离步骤进行DNA序列分析的测序方法，所述DNA序列比可由常规桑格测序法所能分析的序列长度更长，该方法的特征在于：采用其双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比彼此不同的两种核苷酸混合物来产生DNA片段。

背景技术

已经知道，桑格双脱氧核苷酸介导的链终止法是用于分析DNA核苷酸序列的常规方法。在桑格法中，DNA核苷酸链通过和在戊糖的C-3位含有取代的羟基的脱氧核苷酸(dNTP)反应而延长，并通过和在戊糖的C-3位不含有取代的羟基的双脱氧核苷酸(ddNTP)反应而终止。

在桑格法中，四种dNTP如脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)用作产生与模板DNA互补的DNA片段的底物。四种ddNTP如双脱氧鸟苷三磷酸(ddGTP)、双脱氧腺苷三磷酸(ddATP)、双脱氧胸苷三磷酸(ddTTP)和双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于终止互补DNA片段的链延长反应的底物。与dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羟基。因此，当ddNTP和延长反应中的互补DNA片段的末端反应时，互补DNA片段的链延长反应被终止。

因此，在桑格法中产生了不同长度的其末端被ddNTP终止的DNA片段。在桑格法中，产生了与模板DNA的核苷酸数目相对应的不同的互补DNA片段，进而通过电泳，按分子量的顺序将其进行分离。之后，通过测定每个互补DNA片段的末端碱基来识别模板DNA的核苷酸序列。

然而，尽管桑格法很方便，但是它的一个缺陷在于，由于互补DNA延长反应的持续合成能力是有限的，只有长度在500-700bp的DNA可以被准确测定。例如，为了准确和完整地识别平均长度为2Kb的人类cDNA，DNA测序步骤需要通过对人类cDNA的分割来重复三次以上。如上所解释的，作为长DNA的测序方法，桑格法是一种费时、费力和昂贵的方法。

同时，在所谓的鸟枪法(已知是用于基因组DNA的大规模核苷酸测序方法)中，全长DNA被分割为几个DNA片段，分别识别每个片段的碱基的序列。之后，使用计算机相互比较每个片段的序列，通过删除重叠部分来分析全长DNA序列。在上述鸟枪法中，利用可通过一次DNA序列分析识别的DNA长度的扩展来缩减全长DNA序列分析所需的时间和劳力。

通常，在常规的桑格双脱氧核苷酸介导的链终止方法中，采用单一的DNA聚合酶。因此，对应于模板DNA20-30bp的短DNA片段和对应于模板DNA600-700bp的长DNA片段少量生成。然而，对应于模板DNA40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和长DNA片段的含量相对较低，从而DNA两端末端部分的核苷酸序列比其中间部分难以测定。

由于上述原因，可通过对核苷酸序列的一次分析进行分析的DNA的长度实际上受到限制。因此，人们长期以来为得到一种新方法进行了多种研究，该方法应能扩展通过核苷酸序列的一次分析来识别的DNA长度，所述核苷酸序列的一次分析是借助对模板DNA两端末端部分更准确的测定进行的。

发明的公开

因此，本发明的目的在于提供一种通过核苷酸序列的一次分析测定较长DNA序列的方法以及该方法所用的试剂盒。本发明的方法是对常规桑格DNA测序方法的改进，它可以用于测定比可由桑格测序方法所测定的更长的DNA。

在凭借双脱氧核苷酸介导的链终止反应的常规DNA测序方法中，核苷酸混合物中ddNTP与dNTP的摩尔比(在下文中，ddNTP与dNTP的摩尔比以“ddNTP/dNTP”表示)为约0.02，也就是说，ddGTP/dGTP是0.02-0.05；ddATP/dATP是0.02-0.058；ddTTP/dTTP是0.02-0.1；ddCTP/dCTP是0.02-0.033。

本发明的目的是通过提供如下一种方法实现的：采用其中双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比彼此不同的两种以上的核苷酸混合物，即采用其中双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比高于常规桑格法中的摩尔比或低于常规桑格法中摩尔比的两种以上的核苷酸混合物进行DNA序列分析的方法。