[发明专利]疟疾疫苗

说明书

本发明涉及针对疟疾的疫苗。本发明还涉及能够在受试者体内引发针对疟疾的免疫学和保护性应答的多肽，及其在预防中的用途。

疟疾是受感染蚊子在吸血过程中将子孢子接种到哺乳动物宿主体内从而得到传播的寄生虫病。几分钟内，子孢子就侵入肝细胞，并在细胞内通过无性裂殖发育成裂殖子。然后裂殖子侵入红细胞，产生与疾病有关的各种症状。当配子体在蚊子(传病媒介)吸血过程中被摄取时，即完成了生活周期。

通过用辐照减毒的子孢子免疫小鼠和人，可以获得针对疟疾的保护性免疫。该免疫力是中和抗体识别血流中游离子孢子及CD4⁺和CD8⁺T细胞阻止寄生虫肝形式发展的作用结果。在B细胞缺陷小鼠中进行的实验证明，尽管存在抗子孢子抗体，保护作用由经辐照的子孢子免疫诱导。这说明在肝细胞内阶段存在的蛋白质特异性T细胞在保护中发挥重要作用。因此，疟疾疫苗研究的目的之一是模拟由注射经辐照子孢子诱导的保护性免疫应答。

在得出本发明的研究中发现，使用固相肽合成法产生的、包含伯格氏鼠疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白C端区域69个氨基酸(PbCS 242-310)的多肽，在存在不完全弗氏佐剂(IFA)的条件下，尾基皮下注射2次后，在BALB/c小鼠(H-2d)中引发(i)高滴度的抗肽抗体，该抗体还识别天然的伯格氏鼠疟原虫CS蛋白，(ii)针对主要组织相容性复合物(MHC)抗原Kd限制性肽PbCS 245-253特异的溶细胞性T细胞，和(iii)针对子孢子诱导的疟疾的部分CD8⁺依赖性的保护作用。通过IFN-γ ELISPOT，在用短的最佳CTL肽245-253或多肽242-310免疫的动物的引流淋巴结中，发现了相同频率的肽PbCS 245-253特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，说明较长的多肽在MHCI型而言的体内加工及呈递正如短的CTL肽一样有效。有趣的是，当C端肽中存在的4个半胱氨酸残基被完全氧化后，观察到甚至更高水平的CTL活性和保护作用。这些发现指出了C端片段的化学本性对于激活免疫系统及伴随的保护作用的潜在重要性。更一般而言，由于免疫系统的多个方面受到长的合成多肽的刺激，这些可能为用重组蛋白质片段或短肽进行疫苗接种提供有价值的选项。

根据这个发现，本发明提供了针对疟疾的疫苗(特别是用于人类)，该疫苗包括具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽至少包含4个末端半胱氨酸，其中至少一对被氧化，该疫苗任选的还包括合适载体和/或佐剂和/或生物可降解微囊。生物可降解微囊是大约1-10μm的球体，和用于本发明疫苗的非常合适的载体和/或佐剂。

具体而言，本发明的疫苗是基于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)环子孢子蛋白，更具体而言，是恶性疟原虫NF54株。

优选疫苗中的多肽由衍生自环子孢子蛋白C端部分的至少42个连续氨基酸组成。更特别的，本发明所涉及疫苗中的多肽至少包含恶性疟原虫的第342-383位氨基酸，甚至更特别的，至少包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。

优选由恶性疟原虫环子孢子蛋白C端部分衍生的多肽中存在的所有4个半胱氨酸都被氧化。

发现当佐剂是Montanide^TM时本发明的疫苗特别有用。Montanid^TMISA佐剂(Seppic，巴黎，法国；ISA＝不完全Seppic佐剂)是一组基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢矿物油和可代谢矿物油之一或二者混和物组合。将它们与水性抗原溶液制备成乳剂以供使用。各种Montanide ISA佐剂组以油包水乳剂、水包油乳剂、或水包油包水乳剂使用。由于表面活性剂与油组合的多样性，不同的佐剂采用不同的水相/油相比率。这些佐剂的性能据说与用于抗体生成的不完全弗氏佐剂(IFA)相似；然而炎症应答通常较小。

本发明还涉及具有疟原虫属的种环子孢子蛋白C端部分的氨基酸序列的多肽，该多肽包含至少42个连续C端氨基酸，其中一对或多对半胱氨酸被氧化。

在本发明的特定实施方案中，多肽包含恶性疟原虫NF54株的第342-383位氨基酸。

优选多肽中存在的所有半胱氨酸残基都被氧化。

此外，本发明涉及在针对疟疾的疫苗中使用的这种多肽，以及这种多肽用于制备针对疟疾的疫苗的用途。

本发明将在下文实施例中进一步阐明，这些实施例绝非意欲限制本发明。

在实施例中，参考了所示附图：