[发明专利]从含假单胞菌酸复合体的培养液中分离假单胞菌酸A的方法

说明书

本发明领域

本发明涉及从含假单胞菌酸复合体的培养液中分离假单胞菌酸A(莫匹罗星)的方法。

本发明背景

假单胞菌酸A，也称为莫匹罗星，是一种具有式(I)的抗生素：

已知荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)菌株能够生物合成假单胞菌酸A，以及少量其他相关的用字母B-D表示的抗生素[E.B.Chain，G.Mellows，J.Chem.Soc.Perkin Trans I.318(1977)；J.P.Clayton等，Tetrahedron Lett.，21，881(1980)；P.J.O.Hanlon，N.H.Rogers，J.Chem.Soc.Perkin Trans I.2665(1983)]，分别以式(II)-(IV)表示：

从治疗的观点来看，假单胞菌酸抗生素中最有价值的是假单胞菌酸A，它主要有抑制革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae))和一些革兰氏阴性菌(如流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))生长的作用，其最低抑制浓度为0.02-0.5mg/dm³。假单胞菌酸A通过抑制异亮氨酸-tRNA合酶对病原菌的肽合成有一定作用[J.Hughes和G.Mellows，Biochem.J.191，209-219，(1980)]。这种抗生素有利的特性在于它对人类和动物具有较小的毒性，并且在埃姆斯测验法中为阴性。目前假单胞菌酸A以各种制剂用在人体治疗中，用于皮肤感染(如脓疱病、脓皮病)、鼻子和外耳感染、痤疮、烧伤、湿疹、牛皮癣的治疗，在溃疡的情况下用于治疗继发感染，以及用于防止医院感染。

从含抗生素复合体的培养液中分离假单胞菌酸A的一种方法是液-液萃取。根据德国专利2,227,739号和美国专利4,289,703号，向发酵培养液中加入可溶的钡盐，然后通过离心法分离带有不可溶钝化剂的微生物细胞，最终用甲基异丁基酮萃取抗生素。然后，用碱性水溶液从甲基异丁基酮萃取液中移出抗生素，通过甲基异丁基酮的反萃取提纯产生的碱性含水萃取液。将得到的粗产品层析，从假单胞菌酸抗生素复合体制备酯衍生物，并用制备型薄层层析法进行提纯。通过水解得到纯抗生素的酸的形式。

比利时专利870,855号涉及一种方法，在该方法中培养液用甲基异丁基酮萃取，用碳酸氢钠溶液从萃取液中萃取活性物质。通过过滤分离在碱性水溶液中不溶的物质，然后，对滤液的pH进行酸化，并用甲基异丁基酮萃取。最终通过浓缩萃取液和从甲基异丁基酮-正庚烷混合物中结晶得到假单胞菌酸A。

日本专利52-70083涉及两种从培养液中回收假单胞菌酸A的方法。根据其中一种方法，通过离心法从培养液中分离细菌细胞，然后用乙酸乙酯从上清液中萃取活性物质。然后用碳酸氢钠溶液从乙酸乙酯相中反萃取假单胞菌酸复合体，经酸化后再次用乙酸乙酯萃取。经蒸发后使用氯仿-甲醇洗脱剂将残余物在硅胶柱上提纯，最终通过从二异丙醚中结晶得到纯的假单胞菌酸A。在另一种方法中，通过使用甲醇-氨洗脱剂在DEAE-Sephadex阴离子交换柱上对由上述方法得到的粗产品进行层析，分离出含假单胞菌酸A的部分。

A.D.Curzons描述了通过锂盐的形成从培养液中回收假单胞菌酸A(欧洲专利0 005 614号)。使在pH4.5下得到的含活性成分的甲基异丁基酮萃取液与溶解在甲醇中的2-乙基己酸锂反应。分离沉淀的假单胞菌酸A锂盐，将其溶解在水中，将在pH4.5下释放的假单胞菌酸A萃取进入甲基异丁基酮中并在正庚烷的存在下沉淀。