[发明专利]对真菌毒素具有抗性的转基因植物和方法

说明书

本发明涉及转基因宿主，特别是具有单端孢烯(trichothecene)抗性的转基因植物、植物组织、种子、和细胞，及其产生和使用方法。本发明还涉及用于在植物、植物组织、种子、或植物细胞上预防和/或减少真菌生长的方法。本发明还涉及预防和/或减少植物、植物组织、或种子真菌毒素污染。本发明还涉及使用单端孢烯作为转化方案中的选择剂。

很多真菌对重要的经济农作物具有严重危害。而且，真菌毒素对农作物的污染是世界范围的主要农业难题。真菌毒素是经常在农业产品中发现的有毒真菌代谢物，它能够引起脊椎动物的健康问题。单端孢烯是由镰孢属(Fusarium)、单端孢属(Trichothecium)、和漆斑菌属(Myrothecium)物种产生的倍半萜烯环氧化物真菌毒素，是真核蛋白质合成的强抑制剂。产生这些单端孢烯的镰孢属物种包括尖圭镰孢(F.acuminatium)、F.crookwellense、大刀镰孢(F.culmorum)、木贼镰孢(F.equiseti)、禾本科镰孢(F.graminearum)(玉蜀黍赤霉Gibberellazeae)、桑砖红镰孢(F.lateritium)、早熟禾镰孢(F.poae)、接骨木镰孢(F.sambucinum)(虱状赤霉G.pulicaris)、和拟分枝孢镰孢(F.sporotrichioides)(W.F.O.Marasas、P.E.Nelson、和T.A.Toussoun，1984)。

正如先前描述的(A.E.Desjardins和T.M.Hohn，植物发病机理中的真菌毒素，植物与微生物的分子相互作用(Mol.Plant-MicrobeInteract.)10(2)：147-152，1997)，农场动物和人的急性和慢性真菌毒素中毒症都与食用被产生单端孢烯真菌毒素的镰孢属物种污染的小麦、黑麦、大麦、燕麦、稻、和玉米有关。使用低剂量水平化学纯的单端孢烯的实验再现了在动物发霉谷粒中毒症中观察到的许多特征，包括贫血、免疫抑制、出血、呕吐和拒绝进食。人群的病史和传染病学资料指出了某些传染病与食用被产生单端孢烯的镰孢属物种感染的谷物之间的联系。特别提到的是，十九世纪俄国爆发的致命的消化器官中毒性白细胞缺乏症与食用被产生单端孢烯T-2毒素的镰孢属物种污染的过冬谷物有关。在日本，称为akakabi-byo或赤霉病的类似疾病的爆发与被产生单端孢烯，脱氧瓜蒌镰孢醇(以下称“DON”)的镰孢属物种感染的谷物有关。在对印度和日本最近爆发的人类疾病负有责任的有毒谷物样品中检测到单端孢烯。因此，存在对用于预防的农业方法和真菌毒素污染水平减少的农作物的需要。

此外，产生单端孢烯的镰孢属物种是破坏性的病原体，它们攻击广泛的植物物种。单端孢烯的急性植物毒性及其在植物组织中的存在还说明，这些真菌毒素在镰孢属对植物的发病中具有作用。这意味着真菌毒素在疾病中具有作用，因此，减少其对植物的毒性同样可能预防或减少植物疾病。此外，疾病水平的降低可能还有其它好处，即降低真菌毒素对植物(特别是谷物)的污染，这里的植物指谷类植物。

已经用于控制植物疾病(诸如玉米穗腐烂、原种腐烂、或小麦尖枯萎)的各种方法获得了不同程度的成功。控制植物疾病的一种方法是对农作物施用抗微生物的化学药品。这种方法有很多本领域周知的问题。或者，最近的方法包括使用生物学控制生物(“生物控制”)，即有害生物的天然竞争者或抑制者。然而，大面积应用生物控制是困难的，使那些活的生物长时间停留在治理地区甚至更困难。最近，重组DNA技术提供了将克隆基因插入植物细胞从而表达抗微生物化合物的机会。然而，这种技术使得人们更加关注微生物最终对众所周知的、天然存在的抗菌剂的抗性。因此，存在鉴定天然存在的抗微生物试剂的持续需要，诸如可以通过单基因转化由植物细胞直接产生的蛋白质。

已经在拟分枝孢镰孢中鉴定了催化许多不同镰孢单端孢烯(包括DON的C3羟基)的乙酰化反应的单端孢烯3-O-乙酰基转移酶(S.P.McCormick、N.J.Alexander、S.C.Trapp、和T.M.Hohn，来自拟分枝孢镰孢、编码单端孢烯3-O-乙酰基转移酶的基因，TRI101的断裂，应用和环境微生物学(Applied.Environ.Microbiol.)65(12)：5252-5256，1999)。单端孢烯在C3-OH的乙酰化显著降低其在脊椎动物和植物中的毒性，并产生反应产物3-乙酰脱氧瓜蒌镰孢醇(以下“3ADON”)。参阅Kimura等人，见下文。