[发明专利]用于保存感染性重组腺病毒的组合物

说明书

发明领域

本发明涉及保存呈稳定形式的可储存腺病毒，以及用于这种保存的液体或冻凝组合物。

背景技术

保存稳定组合物中的腺病毒是一个已知的问题，该问题已成为许多研究工作的课题，直到现在还未得到真正令人满意的结果。事实上，这些重组病毒只是在达到在未发生降解以及没有失去其感染能力之时将它们储存的条件下才是可使用的。

溶液中腺病毒颗粒的物理状态随时间流逝同时而快速地发生两种变化：一方面病毒颗粒聚集(冻凝)呈团或丝状，因为这种现象是不可逆的，所以是极严重的，而另一方面，衣壳本身的二十面体结构分裂(通过衣壳溶胞作用，衣壳体释放到介质中)。

在国际申请WO 98/02522中，曾描述一种在含有蔗糖的水溶液中保存呈悬浮液形式的感染重组病毒的方法。推荐的组合物不含有甘油，按照优选实施方式含有至少一种二价阳离子盐或一价碱金属阳离子盐。

但是，可能表明蔗糖没有系统地带来在+4℃的稳定作用，根据这种情况，在这个温度下的稳定作用从未超过2星期，或至多也短于2个月。

在《病毒学杂志》(J.Virology)，70(11)，7498-7509(1996)中，曾描述以三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘油为主要成分的缓冲液形式保存腺病毒，但该缓冲液系统地含有氯化镁。这些制剂必需保存在非常低的温度下，约-70℃，以免其感染能力降低。

在《人体基因治疗》(Human Gene Therapy)，7，1693-99(1996)中，还使用一种以三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘油为主要成分的含有氯化镁的储存制剂。这个制剂保存在-80℃。

更一般地，直到今天在该文献中描述的以三羟甲基氨基甲烷为主要成分的制剂系统地含有氯化镁(一般1毫摩尔)或/和具有生理浓度的盐(一般，150毫摩尔NaCl)。作为示例，例如可以列举[《细胞》(Cell)，68，143-155(1992)；《自然遗传学》(Nature Genetics)，3，229-234(1993)；《人体基因治疗》，6，5-11(1955)；《人体基因治疗》，6，145-153(1995)；《人体基因治疗》，6，277-287(1995)；《人体基因治疗》，6，643-666(1995)；《人体基因治疗》，6，1039-1044(1995)；《人体基因治疗》，6，1317-1322(1995)；《人体基因治疗》，6，1587-1593(1995)；《人体基因治疗》，7，2177-2184(1996)；《病毒学杂志》，73，1601-1608(1999)]。这些作者明确指出，病毒保存系统地在-70℃/-80℃下完成。

自此曾表明，病毒结构的演变(聚积和溶解)是一个非常依赖于如某些添加到溶液中反阳离子浓度因素，也非常依赖于如腺病毒浓度因素的现象。在约1E12pv/毫升浓度以上，根据使用的药物组合物，在几小时至几天内可观察到衣壳聚积和分裂作用(因此丧失感染能力)，而在低浓度下，这些现象变得比较缓慢。因此，长时间保存高度浓缩的病毒颗粒组合物是特别困难的。

于是，人们发现并且构成本发明目的的是，在温度+4至+20℃之间，能够在缓冲溶液中呈悬浮液状保存在含水介质中的感染重组病毒，所述缓冲液能够将介质的pH固定在弱碱性值，而缓冲液中被加入了甘油，但是未添加二价金属阳离子或碱金属阳离子。

更确切地，介质的pH固定在8.0-9.6。

在添加甘油的缓冲液中含有腺病毒颗粒的液体或冻凝组合物属于本发明的范围。这些组合物具有的突出优点是良好的稳定性，同时特别适合长期保存高浓度病毒颗粒。

根据本发明，能够将介质的pH固定在8.0-9.6的缓冲溶液，或者由含有Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]或赖氨酸与选自强酸(例如盐酸)或弱酸(例如马来酸、苹果酸或乙酸)的酸的酸/碱体系组成，或者由含有Hepes[2-(4-(2-羟基乙基哌嗪)-1-基)乙烷磺酸]和强碱(例如氢氧化钠)的酸/碱体系组成。

优选地，pH固定在8.4-8.8，更优选地固定在8.4(在25℃测量值)。

以在对pH值不会产生不利影响的范围或体积内施加缓冲作用的方式确定缓冲液的浓度。酸+碱的摩尔浓度可以是10-500毫摩尔，优选地是20-100毫摩尔，更优选地是固定在20毫摩尔。在本发明的缓冲体系中，Tris/HCl缓冲溶液在浓度20毫摩尔可得到特别令人满意的结果。

根据本发明，该组合物含有10-50％甘油，优选地是20-25％(体积/体积)。