[发明专利]α－琼脂糖酶及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及α-琼脂糖酶及其生产方法。具体来说，本发明涉及可用于生产具有琼脂糖各种生理活性、聚合程度低的琼脂寡糖的α-琼脂糖酶和生产α-琼脂糖酶的方法以及α-琼脂糖酶的用途。本发明还涉及具有α-琼脂糖酶活性的多肽以及编码所述多肽的基因。具体来说，本发明涉及α-琼脂糖酶的氨基酸序列以及编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述α-琼脂糖酶可用于生产具有琼脂糖各种生理活性、聚合程度低的琼脂寡糖。而且，本发明涉及应用基因工程生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法。此外，本发明涉及采用具有α-琼脂糖酶活性的多肽生产琼脂寡糖的方法。

背景技术

琼脂糖是琼脂的主要成分。琼脂糖是一种多糖，它具有其中D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3-键和β-1，4键交替连接在一起的结构。人们必须使琼脂糖降解为小分子，以便由琼脂产生寡糖。已知化学降解琼脂糖的方法和酶消化降解琼脂糖的方法用于此目的。在化学降解法中，可使用酸水解琼脂糖。在这种情况下，主要裂解α-1，3键。已知两种酶可消化琼脂糖，一种是β-琼脂糖酶，它裂解琼脂糖中的β-1，4键，另一种是α-琼脂糖酶，它裂解琼脂糖中的α-1，3键。

裂解琼脂糖的β-1，4键获得的寡糖称为新琼脂寡糖。新琼脂寡糖在其还原末端具有D-半乳糖，而其聚合程度表现为偶数。另一方面，裂解琼脂糖α-1，3键获得的寡糖称为琼脂寡糖。琼脂寡糖在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖，而其聚合程度表现为偶数。最近证实在其还原末端含有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖具有生理活性，例如诱导细胞凋亡活性、抑癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性、抗过敏活性、抗炎活性以及抑制α-糖苷酶活性(WO99/24447、日本专利申请号11-11646)。鉴于其生理活性，所以可提供含有琼脂寡糖作为其活性成分的药用组合物和功能食品或饮料。

在化学降解琼脂糖的方法中，难以控制所产生的寡糖的大小。尤其是难以选择性产生聚合程度低的小分子寡糖(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49：734(1991))。如果使用β-琼脂糖酶，则因为该酶只裂解β-1，4键而只能获得没有上述生理活性的新琼脂寡糖。

预期通过采用具有裂解α-1，3键活性的α-琼脂糖酶产生具有生理活性的琼脂寡糖。已知的α-琼脂糖酶包括革兰氏阴性海洋细菌株GJ1B产生的酶(Carbohydrate Research，66：207-212(1978)；该菌株在European Journal of Biochemistry，214：599-607(1993)中称为异单胞菌属(Alteromonas)琼脂裂解菌株GJ1B)和弧菌属(Vibrio)细菌(JP-A 7-322878；JT0107-L4株)产生的酶。然而，采用异单胞菌属琼脂裂解菌株GJ1B产生的α-琼脂糖酶不能产生具有显著生理活性的琼脂二糖，因为所述酶不能消化己糖或较短的寡糖。此外，弧菌属细菌产生的α-琼脂糖酶不能用来利用琼脂糖作为原料产生琼脂寡糖，因为该酶只对己糖和较短的寡糖具有活性，而对琼脂糖根本没有作用。

如上所述，现有技术关于产生在其还原末端含有3，6-脱水-L-半乳糖而且具有各种生理活性的小分子琼脂寡糖(例如琼脂二糖和琼脂四糖)存在各种问题。

发明目的

本发明主要目的是提供可用于有效产生小分子琼脂寡糖的具有α-琼脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、编码所述多肽的基因、产生所述多肽的方法以及产生所述小分子琼脂寡糖的方法。发明概述

由于存在上述各种问题，所以本发明人进行了深入研究，以便获得裂解琼脂糖的α-1，3键而且产生具有显著生理活性的琼脂寡糖的酶。因此，本发明人成功发现了产生具有适用于此目的的特性的酶的两个微生物菌株。分离这两种微生物产生的酶，并阐明其物理化学特性以及酶学特性。此外，本发明人成功分离了所述酶的基因，而且找到了通过采用所述基因的基因工程容易地产生具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法，因此而完成了本发明。

本发明概述如下。本发明的第一方面涉及具有以下物理化学特性的新型α-琼脂糖酶：

(1)作用：水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键；

(2)底物特异性：作用于琼脂糖、琼脂己糖和较琼脂己糖更长的琼脂寡糖，但是对琼脂四糖没有作用；

(3)最适温度：在55％或更低温度下呈现其酶活性；以及

(4)热稳定性：于48℃处理30秒后保留其20％或更高活性。