[发明专利]用天冬氨酸通过酶促的转氨基作用生产L－膦丝菌素的方法

说明书

本发明涉及农作物保护剂合成的技术领域，特别是L-2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸(L-膦丝菌素，L-PPT)的合成，该合成是自4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸(HMPB，PPO)，在有天冬氨酸，PPO-特异性天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)存在的情况下，通过酶促的转氨基作用进行的。化合物L-PPT，它的盐和某些衍生物是具除草活性的非-蛋白原性氨基酸或其衍生物和盐(DE-A-2717440)。每种化合物的L-形式是生物活性的，而每种化合物的D形式实际上是非活性的(DE-A-2856260)。

先前已经公开了转氨酶由于其高立体选择性和相对较宽的底物特异性，其对于自氨基酸的酮酸前体生产相应氨基酸的手性酶促合成是特别适宜的。然而，转氨酶工业使用的一个缺点是，其大约为1的平衡常数，通常仅能得到所需要产品50％的产率(US-A-4,826,766)。EP-A-0344683和US-A-5,221,737描述了除草剂L-膦丝菌素[(L-同型丙氨酸-4-基(甲基)次膦酸，L-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸，L-PPT)]，一种非蛋白原性氨基酸的制备，该制备是用来源于大肠杆菌的4-氨基-丁酸：2-酮戊二酸转氨酶(GABA转氨酶，EC2.6.1.19)，自相应的酮酸[(2-氧代-4-(羟基)(甲基)膦基)丁酸，PPO)]，通过转氨基作用进行的。定量转化需要很多摩尔量的氨基供体谷氨酸，其使反应产物难于纯化。

此问题的一个解决办法是使用天冬氨酸作为氨基供体，这是因为相应的酮酸草酰乙酸在含水介质中是不稳定的，并自发地脱羧为丙酮酸。反应产物自平衡的除去使得逆反应不能进行，而甚至是使用等摩尔的酮酸和供体氨基酸，也可以进行定量转化。此类型的方法在EP-A-0135846中描述。

然而，还没有记载将此原理应用至L-膦丝菌素的酶促合成，这是因为所述GABA转氨酶不接受天冬氨酸作为氨基供体，且没有任何已知的对L-膦丝菌素和天冬氨酸具有接合特异性的转氨酶。

另外，(EP-A-0249188和EP-A-0477902)已经提出了由PPT特异性转氨酶和谷氨酸：草酰乙酸转氨酶(GOT，EC2.6.1.1)组成的偶联2-酶系统。在此反应过程中，用于L-PPT合成中的谷氨酸是通过GOT自天冬氨酸再生的。天冬氨酸转氨酶自身对于L-PPT/PPO是没有特异性的。草酰乙酸自发转化成丙酮酸还导致总反应中平衡向L-PPT合成的方向移动。在这种情况下，使用等摩尔PPO和天冬氨酸的定量产品产率明显少于使用等摩尔量谷氨酸的。

此偶联酶方法与受体酮酸PPO相比，可以明显减少底物溶液中存在的多余供体氨基酸，其简化了产品溶液的处理。然而，在偶联反应过程中仍然需要使用谷氨酸，其在与酮戊二酸的平衡中，保留在反应产物中或必须通过复杂的纯化方法将其自结构上非常相似的氨基酸L-PPT中除去。此外，由于不同的动力学参数，使用2种酶的反应过程比使用1种酶的更难于最佳化。

虽然，先前已经公开了天冬氨酸转氨酶如GOT，不转化PPO，人们已经惊奇地发现了一种来源于微生物的天冬氨酸转氨酶，其同样以高特异性将L-PPT/PPO用作为底物。这些酶催化天冬氨酸的α-氨基直接转化为PPO。

因此，本发明涉及一种制备通式(I)的L-2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸(L-膦丝菌素，L-PPT)，其衍生物和/或盐的方法，该方法是自作为受体的通式(II)的4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸(HMPB，PPO)，其衍生物和/或盐

在有天冬氨酸作为供体的情况下，通过酶促的转氨基反应进行的，转氨基反应是在有一种或多种受体特异性的，特别是PPO特异性的天冬氨酸转氨酶(Asp-TA)存在的情况下进行的，优选在有一种或多种热稳定和/或分离的天冬氨酸转氨酶存在的情况下，更优选在有一种或多种对丙酮酸具有最小底物特异性的的天冬氨酸转氨酶存在的情况下进行，以提供草酰乙酸和通式(I)的化合物，其衍生物或盐，以便减少或基本上避免副产物丙氨酸的形成。

L-PPT的盐通常是与无机和/或有机酸的盐或与无机和/或有机碱的单-和二盐。与酸的盐(酸加成盐)是，例如，与无机酸如盐酸(氢氯化物)或硫酸(硫酸盐)，或与碳酸(碳酸盐，碳酸氢盐)或与有机酸如醋酸(醋酸盐)，甲酸(甲酸盐)，丙酸(丙酸盐)或酒石酸(酒石酸盐)的盐。与碱的盐是，例如，碱金属和碱土金属盐，铵盐，与有机胺如伯，仲或叔胺的盐，和季铵盐。