[发明专利]重组血小板胶原受体糖蛋白VI及其药用

说明书

本发明涉及糖蛋白VI(GPVI)、其分离、纯化以及重组生产方法。特别是，本发明涉及GPVI，优选地重组GPVI的用途，其用于治疗与血液凝固紊乱直接或间接相关的紊乱和病理事件(如血栓和心血管疾病)。胞外重组蛋白质也可用于建立筛选鉴定法，以找到膜结合GPVI潜在的抑制剂，目的在于抑制血小板与胶原的相互作用。血小板在体内生存期间，位于血小板表面的GPVI被修饰，因此其可用作血小板年龄曲线的标记。

糖蛋白VI为62/65kDa(分别为非还原的/还原的)血小板膜糖蛋白，其与Fcγ共同亚基一同形成复合体。GPVI亚基包含胶原结合位点，Fcγ亚基负责信号传递。该复合体形成了血小板表面的主要胶原受体之一，对应答胶原所致血小板活化是关键的。胶原上的识别序列由(GlyProHyp)_n序列组成。具有GPVI遗传缺陷的患者公知来自日本。他们有轻度的出血问题，并且他们的血小板对胶原只有弱反应，可能是通过其它受体进行的。对起源于GPVI的信号传递级联放大已有许多了解，其非常类似于那些免疫受体，包括T-细胞受体、B-细胞受体和天然杀伤细胞受体。这些级联包括src家族酪氨酸激酶，如Fyn、Lyn以及p72^SYK和许多其它的酪氨酸激酶、磷酸酶、衔接蛋白质(如LAT)。这些级联的一个主要目标是活化磷脂酶Cγ2，其将磷脂断裂开，产生第二信使：二酰甘油和IP₃。GPVI被认为参与了血小板整合蛋白α₂β₁的活化，其在血小板与受损血管壁的粘附中起主要作用。“敲除”Fcγ亚基的小鼠具有仍显示可与胶原反应的血小板，暗示休眠状态的α₂β₁也可被GPVI/Fcγ复合体调节。血小板胶原受体GPVI与p58KAR家族的天然杀伤激活受体以及FcαR紧密相关。

休眠的、循环血小板在血管损伤处的粘附和活化是导致血栓形成过程的第一步，其可转换为止血栓。胶原是血管壁负责血小板活化的主要成分之一。存在许多类型的胶原，在内皮下层发现了其中7种。在血小板上已确定了一些不同的胶原受体，但目前认为主要的胶原受体为整合蛋白α₂β₁和非整合蛋白GPVI。虽然对α₂β₁的特性有充分了解，并且几年前就对两个亚基进行了克隆及序列测定，但对GPVI的结构仍然不清楚，尽管对其一些特性已经确定。大约二十年前已确定GPVI是一个主要的血小板糖蛋白，其分子量在60-65kDa范围内，具酸性pI。它作为推定的胶原受体的角色是通过在日本鉴定的一位轻度出血紊乱患者而建立，该患者的血小板显示对胶原反应的特异性缺陷，并且缺乏这个受体。该患者也产生了针对缺陷受体的自身抗体，它们被用来进一步表征该分子的特性。最近确定了GPVI与共同的Fcγ亚基非共价地结合，后者作为复合体的信号传递部分而起作用。也阐明了胶原上的GPVI识别序列为位于胶原三联螺旋结构内的重复Gly-Pro-Hyp三联体，并且基于此结构合成的肽可用作特异的GPVI导向的激动剂。GPVI/Fcγ复合体通过免疫受体样机制，将信号传递至血小板内部，该机制包括p72^sYK的活化和通过激酶/磷酸酶/衔接蛋白质相互作用的级联，导致PLCγ2的活化，且因此释放颗粒和血小板聚集。进一步表征该分子特性的步骤是证实来自响尾蛇属(Crotalus)durissus terrificus热带响尾蛇的蛇C-型凝集素convulxin可以活化血小板，其通过多聚体的相互作用，使GPVI聚集而活化血小板。convulxin显示出特异地结合GPVI，提供了一种与已建立的方法相结合纯化该受体的方法。

因此，从现有技术很清楚：在许多治疗领域GPVI似乎是一种很让人感兴趣的化合物，尤其是关于直接或间接涉及依赖胶原-血小板相互作用的血液凝固事件的应用。因此本发明的目的是以重组体形式提供GPVI，并且显示它作为直接治疗目标或者作为筛选短化合物之工具的有效性，其中的短化合物特别是那些有能力抑制或阻断天然血小板-胶原相互作用的已化学合成的或者可化学合成的化合物。

本发明也涉及GPVI蛋白质的部分或片段，其保持了它们与胶原结合的生物活性。

本发明成功地纯化了足量的GPVI用于初步的表征和肽序列的测定。该序列用于设计PCR引物，以确定在DNA文库中的阳性序列。这个DNA序列然后用作探针，从该文库中分离接近全长的eDNA序列，并且从血小板cDNA文库中用RACE法获得缺失的5’序列。