[发明专利]用于扩增核酸序列的方法

权利要求书

1.一种扩增核苷酸序列的方法，其特征在于所述方法包括：

(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸，以合成与所述模板互补的引物延伸链，其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上，以便用一种内切核酸酶进行切割；

(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链；以及

(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶，从所述双链核酸引物部分的3’-末端延伸与所述模板互补的核苷酸序列，其中切割步骤(b)获得的引物延伸链实现链置换。

2.权利要求1的方法，其中连续重复步骤(b)和步骤(c)。

3.一种用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法，其特征在于所述方法包括：

(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸，以合成与所述模板互补的引物延伸链，其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上，以便用一种内切核酸酶进行切割；

(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链；

(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶，从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与所述模板互补的核苷酸序列，其中切割步骤(b)获得的引物延伸链实现链置换，其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸；

(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板，以合成与所述置换链互补的引物延伸链，其中所述不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物，该引物与所述置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上，以便用一种内切核酸酶进行切割；

(e)用所述内切核酸酶在含有所述核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链；以及

(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶，从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与所述模板互补的核苷酸序列，其中切割步骤(e)获得的引物延伸链实现链置换，其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中恒温进行所述相应步骤。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中使用一种具有链置换活性的DNA聚合酶。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述DNA聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bst DNA聚合酶和热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述内切核酸酶为内切核糖核酸酶。

8.权利要求7的方法，其中所述内切核糖核酸酶为核糖核酸酶H。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述嵌合寡核苷酸引物包含2个或2个以上连续核糖核苷酸残基。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述嵌合寡核苷酸引物含有1个或1个以上修饰核糖核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中所述嵌合寡核苷酸引物包含其中与所述核糖核苷酸的α-位磷原子键合的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸。

12.权利要求1-11任一项的方法，它在含有一种选自Tricine、磷酸盐和tris的缓冲组分的缓冲液中进行。