[发明专利]筛选改良载体的方法

说明书

发明领域

本发明与提高逆转录病毒载体包装效能的方法有关。

发明背景

逆转录病毒载体现广泛用作将基因输入细胞内的运输载体。它们是安全的，易于产生和介导它们转入靶细胞基因组的基因的稳定整合，正是基于此事实，其应用才得以普及。这使得该转运基因的长期表达成为可能(Miller，1997)。

逆转录病毒的产生远非高效。一般地，因为其他的颗粒不携带病毒基因组，在逆转录病毒原液中不到10％的病毒颗粒是具有感染性的。在野生型病毒中，gag/gag-pol基因产物是由全长RNA转录本翻译的，后者也是包装的。不良包装效能的一个假说在于包装和翻译过程之间的竞争(Sonstegard和Hackett1996)。这是由于包装信号与核糖体结合位点过近所致。该gag蛋白质与包装信号的结合阻碍核糖体的结合并且抑制其本身的翻译过程。在进化过程中，未选择更强的包装信号是因为它将与该gag蛋白质更加牢固的结合并且限制其产生。

但是，在制备逆转录病毒载体的过程中，将gag/gag-pol和基因组成成分分离到不同的表达盒中(Soneoka等人，1995)。包装和翻译过程因此得以分开。这样，形成具有高度包装效能的病毒基因组而不危及gag/gag-pol的产生在理论上是可行的。

早先试图通过复制活性病毒的连续传代(Taplitz和Coffin，1997)或通过体外筛选过程(Allen等人，1996；Berglund等人，1997)来获取改良新型逆转录病毒序列。病毒的连续传代需要很长时间。至于体外筛选，有很多需要优化的参数。包括需要进行诱变和筛选的条件。而且，其经常依赖于随机突变文库的大小，后者又反过来依赖于该诱变DNA的成功克隆。

并且，这些早先制备新型逆转录病毒序列的试图，没有一个致力于提高逆转录病毒包装效能以超过其自然效能。

发明简述

在调查病毒成分的化学计量学对应用瞬时转染系统制备逆转录病毒的影响时，我们已经发现可以制备如下的病毒原液，其中基本上所有的颗粒都是感染性的，这是通过确保它们都注满有基因组RNA实现的。我们的结果表明这可以通过应用与env和基因组相比较低比例的gag/gag-pol构建体来实现。

因此，本发明提供提高逆转录病毒包装效能的方法，方法包括在生产细胞中至少表达编码逆转录病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列、编码逆转录病毒被膜多肽的第二核苷酸序列和编码逆转录病毒基因组的第三核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与第二和第三核苷酸序列的比例为x∶y∶z，其中x小于1，并且y和z为1。换句话说，第一核苷酸序列与第二和第三核苷酸序列的比例小于1∶1∶1。

编码逆转录病毒gag-pol多肽的第一核苷酸序列与第二和第三核苷酸序列的比例优选小于0.8∶1∶1或0.5∶1∶1，更优选小于0.2∶1∶1。

感染性逆转录病毒颗粒的数目与所制备的逆转录病毒颗粒总数目的比例优选大于15％，更优选大于25％或50％。

本发明也提供含有逆转录病毒颗粒的组合物，逆转录病毒颗粒依据本发明上述方法制备，并提供生产细胞，该生产细胞具有增强的逆转录病毒包装效能，因为与env和基因组相比，其表达较低比例的gag/gag-pol构建体。

其他增加感染性颗粒的方法是通过修饰包装信号改良该基因组的包装效能。但是到目前为止，识别自然发生病毒包装信号并将其掺入逆转录病毒载体中(Adam和Miller，1988)仅仅是尝试而已。这些载体的包装效能充其量只能达到野生型的水平。

因此我们提出筛选具有改良包装效能的载体基因组的体内策略，使逆转录病毒载体在序列中导入随机突变的Epicurian coli诱变株和哺乳动物细胞间穿梭，其中筛选用以寻找更佳的包装效能(图2)。

增加包装效能使病毒原液含有更多感染性颗粒。这达到高终点滴度，而且，也提高转导效能，因为将反过来阻碍感染性颗粒与靶细胞受体的结合的缺陷颗粒变得更少。

我们所述的体内筛选方法快速易行。仅从哺乳动物和细菌细胞中提取和导入DNA。这些是非常成熟和优化的过程。

相应地，本发明也提供筛选具有改良包装效能的改良逆转录病毒基因组的方法，包括：(a)向含有包装信号的逆转录病毒基因组导入一个或多个随机突变；(b)向表达包装逆转录病毒基因组所需多肽的宿主细胞导入该诱变的逆转录基因组；(c)与含有非-突变包装信号的逆转录病毒基因组相比，检测在该细胞中的逆转录病毒包装效能是否得以改良；(d)筛选具有改良包装效能的病毒基因组。