[发明专利]用于确定抑制性RNA分子的体内选择方法

说明书

                    技术领域

本发明涉及用于选择最佳抑制性RNA分子的体内方法。

                    发明背景

利用抑制性RNA分子抑制靶核酸序列的转录和/或翻译是相当重要的。抑制性RNA分子可以直接或间接地结合核酸序列或其转录产物并实现其切割。这样的例子包括核酶(能直接切割靶序列)、外部指导序列(EGSs)及反义或有义RNA(能通过其它因子引起切割)。

不利的是，由于mRNA复杂的二级结构，上述技术的应用遇到了许多的困难。除非试图定向于每一个位置，通常不可能预计mRNA中开放或易接近的位点的位置。

用于搜寻这些开放区域的一个方法是Southern(1997)和Milner(1997)所述的体外“寡核苷酸排列”方法。不过，这些方法包括费时地产生各个特殊靶mRNA的独特排列。另外，异源双螺旋是在非生理条件下形成的。由于考虑到mRNA在5’和3’末端均结合有许多蛋白质，这一点尤其成问题。

因此使用“体内”选择方法发现正常生理条件下开放的mRNA位点是有利的。另外，此方法一般来说都是有用的，因为所有RNA分子都可用此方法检测，而无需每次凭借特殊的选择方法。

因此，本发明的目的是提供确定有效定向于所给RNA序列的抑制性RNA分子的体内选择方法。

本发明还显示，有可能使用表达靶序列的细胞在体内选择抑制性RNA分子，此靶序列与可检测的标记有效连接，从而使靶序列及可检测标记作为邻接的RNA分子在细胞中表达。

靶序列/可检测标记mRNA将包含正常的5’帽和3’polyA尾。如果5’帽和3’polyA尾被去除(例如，通过抑制性RNA分子从靶序列上切割下来)，mRNA将不稳定而被降解。这将预防可检测标记基因的翻译。

例如，如果可检测标记是能将前体药物转变成细胞毒性化合物的酶，靶序列的切割将使得细胞对前体药物不敏感。

表达可检测标记/靶基因的细胞可用于筛选许多抑制性RNA分子。尤其是，本发明的发明者已利用这样的细胞来筛选核酶表达载体的文库，其中的各核酶具有不同的特异性区域。对前体药物具抗性的细胞包含有活性核酶，然后可用聚合酶链式反应(PCR)之类的技术确定其序列。

为此，本发明提供了适于体内使用的选择系统，该系统包含：

(i)第一核苷酸序列群，这些序列编码的基因产物能直接或间接地与核苷酸序列或其转录产物结合并实现其切割；

其中结合所说核苷酸序列所需之第一核苷酸序列的区域在第一核苷酸序列群间是异质的；

(ii)第二核苷酸序列，其含有：

(a)编码与mRNA稳定及/或翻译所需序列有效连接之可检测标记的编码区；以及

(b)第三核苷酸序列，其位于编码区及mRNA稳定和/或翻译所需序列中至少一种之间；

其中(a)和(b)与调控序列有效连接，此调控序列能指导(a)和(b)作为毗邻的分子在宿主细胞中表达。

本发明提供了载体系统，该系统包含：

(i)载体群，这些载体独立地含有：

所编码的基因产物能直接或间接地与核苷酸序列或其转录产物结合并实现其切割的第一核苷酸序列；

其中结合所说核苷酸序列所需的第一核苷酸序列中的区域在载体群内是异质的；

(ii)第二核苷酸序列，含有：

(a)编码与mRNA稳定及/或翻译所需序列有效连接之可检测标记的编码区；以及

(b)第三核苷酸序列，其位于编码区及至少mRNA稳定和/或翻译所需序列中至少一种之间；

其中(a)和(b)与调控序列有效连接，此调控序列能指导(a)和(b)作为毗邻的分子在宿主细胞中表达，其中第二核苷酸序列存在于载体群中或作为另外载体的一部分。

优选基因产物选自核酶、反义核糖核酸和外部指导序列。

优选该载体是病毒载体，更优选逆转录病毒载体。

优选的可检测标记是选择标记，更优选能将前体药物转变成细胞毒性化合物的酶。在特别优选的实施方案中，该酶是胸苷激酶，而前体药物是丙氧鸟苷(gancyclovir)。

本发明进一步提供了病毒颗粒群，各病毒颗粒含有上述第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列。

本发明还提供了产生上述病毒颗粒群的方法，该方法包括将以下成分引入生产者细胞：(i)上述第一核苷酸序列群，和(ii)上述第二核苷酸序列。还提供了此方法产生的病毒颗粒群。