[发明专利]来源于马尼拉水蛭的透明质酸酶,分离、纯化和重组生产方法

说明书

本发明涉及一种来源于热带水蛭马尼拉水蛭(Hirudinariamanillensis)的新型透明质酸酶的分离、纯化和表征。因此，根据本发明，这种新酶被称为“马尼拉水蛭酶(manillase)”。本发明还涉及马尼拉水蛭酶的重组生产方法，包括DNA和氨基酸序列以及表达载体和宿主系统的公开。最后，本发明涉及马尼拉水蛭酶用于治疗目的的用途，例如，用于治疗心肌疾病、血栓事件和肿瘤。

透明质酸或hyaluronan(HA)是线性不分支的高分子量(2-6×10⁶)葡糖胺聚糖，由重复二糖结构GlcNAc(β1-4)GlcUA组成。其羧基在胞外液体的优势pH下完全离子化，无论是正常的或病理的。HA与硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素均属于葡糖胺聚糖类(Jeanloz R.W.，风湿性关节炎(Arthr Rheum.)1960，3，233-237)。与其他未修饰的葡糖胺聚糖(GAG)不同，它没有硫酸取代或共价连接的肽，其链长度和分子量通常极高。HA普遍分布于结缔组织中，在引入改进的固定方法(Hellstrom S.等人，1990，组织化学杂志(Histochem.J.)22，677-682)和利用hyaluronan结合肽(HABP)的特异组织化学方法后，实际上在身体的所有部分中均发现。它在发育和成熟过程中也存在于神经外胚层来源的组织中。

术语透明质酸酶根据本发明通常是指一种酶，其作用于透明质酸，而无论其对其他底物的活性如何。

透明质酸酶首先从微生物中而后从哺乳动物睾丸中分离，后者现在是其主要来源(Meyer，K.《酶》，1971，307)。

根据反应机制，透明质酸酶被分为主要三类。

第一类微生物酶包括通过β-消除作用于其底物，产生A-4，5-不饱和二糖。因此该酶必须被命名为透明质酸裂合酶，EC 4.2.99.1。

第二类，透明质酸氨基葡糖苷酶或睾丸型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)作为一种内切N-乙酰-β-D-己糖胺酶，将HA降解为较小的片段，首先是在游离还原末端含有己糖胺部分的四糖。与睾丸透明质酸酶有类似性质的酶已经从蝌蚪、蛇毒、蜂毒、大量动物组织、人血清和其他来源中获得。众所周知，来自睾丸的透明质酸酶也具有转糖基酶活性(WeissmanB.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1954，208，417-429)。属于这类透明质酸酶的酶显示不仅对于透明质酸而且对于软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、软骨素和硫酸皮肤素的酶活性。

第三类由透明质酸葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)组成，其作为一种内切-β-葡糖苷酸酶。该酶从欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)中分离(Yuki H.和Fishman W.H.，生物化学杂志1963，238，1877-79)，对HA绝对特异。硫酸软骨素、皮肤素和肝素不是该透明质酸酶的底物。它只将透明质酸降解为在游离还原末端含有葡糖醛酸的四糖(Linker A.等人，生物化学杂志1960，235，924-27)。与哺乳动物内切-β-葡糖胺酶相反，肝素对该水蛭透明质酸酶的活性没有影响。因此，它能与肝素一起对患者施用，其衍生物被广泛用作抗凝剂。EP 0 193 330中公开了来源于水牛水蛭的蛭科亚科(包括Hirudinaria、Illebdella、Poecilodbella、Sanguisoga属)种(Poecilodbella granulosa)的透明质酸特异的内切-β-葡糖苷酸酶(称为“orgelase”)，其分子量约为28.5。