[发明专利]7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－ADCA)的制备方法

权利要求书

1.一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)的方法，特征在于它包括以下几个操作步骤：

a)失活，在生产头孢菌素C的A.chrysogenum菌株中，存在由cefEF

基因编码的酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶/去乙酰头孢菌素C

合成酶(DAOCS/DACS)，通过将该基因阻断，构建一种生产青

霉素N的菌株；

b)表达，在上述生产青霉素N的菌株中，表达编码酶活去乙酰氧

基头孢菌素C合成酶(DAOCS)的cefE基因，构建一种生产去

乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的菌株；

c)在生产DAOC的条件下，培养产DAOC的菌株，并且纯化产

生的DAOC；

d)用D-氨基酸-氧化酶(DAO)将产生的DAOC生物转化为戊二酰-

7-ADCA；

e)用戊二酰基转移酶(GLA)将戊二酰-7-ADCA生物转化为7-

ADCA；

f)纯化生物转化产生的7-ADCA。

2.按照权利要求1的方法，特征在于步骤(d)和(e)通过在cefEF基因已预先失活而cefE基因已表达的A.chrysogenum菌株中表达分别编码酶活D-氨基酸-氧化酶(DAO)和戊二酰基转移酶(GLA)的dao基因和gla基因进行，得到生产7-ADCA的菌株，在生产7-ADCA的条件下培养所述菌株。

3.按照权利要求1的方法，特征在于(d)和(e)步骤通过在cefEF基因已预先失活而cefE基因已表达的A.chrysogenum菌株中表达编码酶活头孢菌素酰基转移酶(CAC)的cac基因，得到生产7-ADCA的菌株，在生产7-ADCA的条件下培养所述菌株。

4.一种生产青霉素N的方法，特征在于权利要求1至3描述的方法中，一旦步骤(a)终止，所有操作即中断。

5.一种DNA化合物，其由pALC73限制性酶切图谱描述，该图谱包含用潮霉素抗性基因(hygR)失活的cefEF基因。

6.携带有权利要求5所述的DNA化合物或其片段的载体。

7.按照权利要求6的载体，特征在于它们为一种质粒。

8.按照权利要求7的质粒，特征在于它为pALC73。

9.转化的宿主微生物，特征在于它们具有通过导入权利要求5的DNA化合物而被阻断的cefEF基因，所述DNA化合物全部或部分包含于权利要求6到8的载体中。

10.按照权利要求9的转化的宿主微生物，特征在于它为原核生物，优选大肠杆菌或放射菌。

11.按照权利要求10的转化的宿主微生物，特征在于它是以CECT5151或其突变株或其转化衍生株为代表的纯大肠杆菌。

12.按照权利要求9的转化的宿主微生物，特征在于它是真核生物，优选顶孢霉属或青霉属。

13.按照权利要求12的转化的宿主微生物，特征在于它为金黄顶孢霉属(Acremonium chrysogenum)或金黄青霉属(Penicilliumchrysogenum)。

14.按照权利要求13的转化的宿主微生物，特征在于它为金黄顶孢霉属或其突变株或其转化衍生株的纯种菌株。

15.一种获得青霉素N产量提高的转化微生物的方法，特征在于包括下列操作步骤：

a)构建携带全部或部分权利要求5所述DNA化合物或其重组DNA

化合物的载体；

b)将上述载体导入A.chrysogenum菌株，使cefEF基因功能失活；

c)筛选出使青霉素N产量和没有转化的对照菌株相比增加的转化

菌株。

16.按照权利要求15的获得转化微生物的方法，特征在于构建的载体是权利要求6到8中描述的那些。

17.按照权利要求16的方法，其中转化的宿主微生物是权利要求9到14描述的那些。

18.一种生产去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，特征在于权利要求1到3描述的步骤中，一旦(c)步骤终止，任何步骤即中断。