[发明专利]用于胆固醇定量的试样预处理方法和以该方法对特定脂蛋白中胆固醇定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及试样的预处理方法，用于以较少试样通过简单操作就可以正确、高效地分离定量存在于特定级分中的胆固醇，以及以此测定特定级分中胆固醇的方法。

背景技术

胆固醇等脂质，在血液中与脱辅基蛋白质一起形成脂蛋白。这类脂蛋白因物理性状的差别，分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。已知上述脂蛋白中，LDL是引起动脉硬化的病因物质之一，另外，HDL显示抗动脉硬化作用。

就是说，从流行病学方面来说，已知LDL中的胆固醇值与动脉硬化性疾病的发病频率呈正相关，而HDL中的胆固醇值与动脉硬化性疾病的发病频率呈免相关。因此，如今，广泛进行LDL或HDL中的胆固醇测定以预防或诊断缺血性心脏疾病。

作为LDL或HDL中胆固醇的测定方法，已知有例如将LDL或HDL通过超速离心与其它脂蛋白分离以后，测定胆固醇的方法，或者利用电泳分离之后进行脂质染色，测定发色强度的方法。不过这些方法操作都很复杂，无法处理大量检品，日常几乎难以应用。

目前，作为HDL中胆固醇的测定方法，临床应用的方法有沉淀法，是向检品中加入沉淀剂，使HDL以外的脂蛋白凝聚，然后离心去除，测定分离出的只含HDL的上清中的胆固醇。该方法与超速离心法和电泳法相比比较简便，但因为包括加入沉淀剂分离操作，需要比较多的检品量，而且产生分析误差的可能性也高，整个分析过程无法自动化。

另外，也讨论了以酶分别定量HDL中的胆固醇的方法。例如，在胆汁酸盐和非离子表面活性剂的存在下，进行酶反应的方法(特开昭63-126498号)。该方法在反应初期的酶反应与LDL中的胆固醇浓度成正比，然后的反应速度虽然利用于与HDL中的胆固醇浓度成正比的关系，但是无法区别HDL中的胆固醇和其它脂蛋白中的胆固醇的反应，存在正确性的问题。

已知有将HDL以外的脂蛋白先凝聚了以后，HDL中的胆固醇单独发生酶反应，然后酶失活同时再溶解凝聚，测定吸光度的方法(特开平6-242110号)。不过，该方法必须要至少添加3次试剂的操作，只适用于有限的自动分析装置，有通用性的问题。而且，再溶解沉淀的时候使用高浓度的盐等，对分析仪器有危害，无法满足试剂废弃的要求。

另外，已知有如下的HDL中胆固醇的测定方法，在第1反应中，在特殊的表面活性剂存在下，胆固醇氧化酶与胆固醇酯酶作用于HDL以外的脂蛋白，在与这些脂蛋白中的胆固醇优先反应之后，抑制对HDL以外的胆固醇的反应，测定HDL中的胆固醇(特开平9-299号)。但该方法与本发明有很大差异，表现在第1反应中，需要将HDL以外的脂蛋白的游离胆固醇以及酯型胆固醇转移到反应体系以外的特殊表面活性剂还有同时需要胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶。

再者，日本专利第2600065号公开了组合使用沉淀HDL以外脂蛋白的沉淀试剂和胆固醇测定试剂，测定不沉淀的HDL中的胆固醇(HDL-C)的方法。实际上可以实施的方法是使用修饰的酶以及以硫酸化α-环糊精作为沉淀剂，因为沉淀剂的效果，生成的混浊对测定体系有妨碍，在测定精度上是存在问题的。

上述专利方法以论文发表在《生物试样分析》第19卷，第5期，305～320页，其中，报道了在用修饰的酶进行HDL-C测定时，仅修饰酶向反应体系中导入，就会造成正误差(与沉淀法相比，显示高值)，因此无法测定高脂血症患者血清中的HDL-C，为避免此现象，以1种聚阴离子硫酸化环糊精和氯化镁作为沉淀剂，测定了HDL-C。

为降低上述专利方法中沉淀剂所产生混浊的影响，有使表面活性剂共存的技术(特开平8-116996号)、使用抗体的技术(特开平9-96637号)、使用糖化合物(特开平7-301636号)等技术，上述无论任何一个都含有引起凝聚的试剂作为条件，基本上无法避免使用聚阴离子等沉淀剂。

最近本发明人等发现，通过利用只作用于特定脂蛋白的物质，不使用沉淀剂也可以正确定量特定级分中胆固醇的方法，提出了专利申请(特愿平9-244821号)。该方法与已有的沉淀法相比，具有极高的相关性，但是与沉淀法测定值的关系，与上述《生物试样分析》中所报告者具有同样倾向，为此，在医疗机构中为了获得与以往沉淀法有可比性的数据，要添加聚阴离子等。

但是，加入聚阴离子等，在测定体系中生成沉淀，有污染测定池等问题或者测定值波动等原因，这是不期望的，强烈要求从体系中排出沉淀物等。另外仅仅为了数据的一致而加入从测定原理是不必要的聚阴离子等，经济上也不合理，也需要解决。