[发明专利]利用免疫玫瑰花结分离细胞的方法

说明书

发明领域

本发明涉及利用免疫玫瑰花结(immunorosettes)分离细胞的方法。本发明包括在本发明的方法中使用的新型抗体组合物。

发明背景

在许多用途中，希望富集(或者，排除)生物样品中的某些细胞群体。血液学、免疫学和肿瘤学领域依赖于外周血样品和来自有关组织(如骨髓、脾脏、胸腺和胎肝)的细胞悬液。从这些异源样品中分离特定细胞型对于这些领域的研究、对某些恶性和免疫/造血疾病的诊断和治疗是关键的。

纯化的免疫细胞(如T细胞和抗原递呈细胞)群体是研究免疫功能所必需的，并在免疫治疗中使用。对细胞、分子和生物化学过程的研究需要分析分离的某些细胞型。大量技术已经用于分离T细胞亚组、B细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞。

造血干细胞的分离也已经是备受关注的领域。纯干细胞群体将促进对血细胞生成的研究，来自外周血和/或骨髓的造血细胞的移植越来越多地与高剂量化学治疗和/或放射治疗结合用于治疗多种疾病，包括恶性、非恶性和遗传疾病。这些移植物中的极少量细胞能长期造血重建，因此有一种强烈需求来发展造血干细胞的纯化技术。此外，严重的并发症和实际上移植方法的成功很大程度上依赖于用于去除移植物中对移植受体造成危险的细胞的方法的效果。这些细胞包括引起异体移植中移植物抗宿主疾病(GVHD)的T淋巴细胞，和可引起恶性生长复发的自体移植物中的肿瘤细胞。通过除去不必要的细胞，从而减少需输入的细胞保藏剂的体积，缩减移植物也是重要的。

在某些情况中，从生物样品如骨髓移植物中除去或排除肿瘤细胞是希望的。支气管、乳房导管和胃肠道及泌尿生殖道的上皮癌代表了今天所能见到的主要的实体瘤类型。微转移肿瘤细胞迁移被认为是上皮癌患者的一个重要的预后因素(Braun等人，2000；Vaughan等人，1990)。检测这些转移细胞的能力受组织或液体取样的效率和肿瘤检测方法灵敏度的限制。一种富集血样中循环上皮肿瘤细胞的技术会提高检测转移疾病的能力，并将促进对这些稀少细胞的研究和确定使疾病扩散的生物学变化。

造血细胞和免疫细胞已经根据物理性质(如密度)和对可杀伤循环细胞的某些药理试剂的敏感性分离。抗细胞表面抗原的单克隆抗体的出现已经大大扩展了区别和分离不同细胞型的能力。用单克隆抗体从血液和相关细胞悬液中分离细胞群体有两种基本方法。它们的不同之外在于是用抗体区别、标记希望的还是不希望的细胞。

在正选择技术中，希望的细胞用抗体标记，并从剩余的未标记/不必要的细胞中移出。在负选择中，标记并移出不需要的细胞。抗体/补体处理和免疫毒素的使用是负选择技术，但是FACS分选和大多数分批免疫吸附技术能适用于正选择和负选择两者。在免疫吸附技术中，细胞用单克隆抗体选择，优先结合到能从剩余细胞中去除的表面上，例如珠柱、烧瓶、磁性颗粒。免疫吸附技术在临床上和研究中受到欢迎，因为它们保持了用单克隆抗体导向细胞的高特异性，但是不同于FACS分选，它们能被放大，以直接处理临床收获物中的大量细胞，它们避免了使用细胞毒性试剂(如免疫毒素)和补体的危险。然而，它们需要利用“装置”或细胞分离表面，如珠柱、淘洗瓶或磁铁。

分离造血干细胞、免疫细胞和循环上皮肿瘤细胞的现有技术全都包括一个初始步骤，来除去红细胞，然后是对一种装置或人工颗粒的抗体介导的粘附。(Firat等人，1988；de Wynter等人，1975；Shpall等人，1994；Thomas等人，1994；Miltenyi Biotec Inc.，Gladbach，德国)。在正选择的情况中，还有另外一个步骤：从该装置或颗粒中去除细胞。所有这些多个步骤都需要时间并且导致细胞损失。Slaper-Cortenbach等人(1990)描述了一种利用形成免疫玫瑰花结净化骨髓的普通急性白血病(cALL)细胞的方法。该方法需要首先从骨髓样品中去除红细胞，并用可结合cALL细胞的抗体标记。标记的红细胞然后被加回cALL细胞已形成免疫玫瑰花结的样品中。当随后还有一个补体介导的cALL细胞裂解步骤时，该排除方法效果最好。