[发明专利]景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶在转基因植物中的表达

说明书

本申请要求于1999年5月13日申请的美国临时申请序号60/133,964的优先权。

                     发明领域

本发明涉及在转基因植物中表达景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)，以增加或改善作物生长和发育、产量、活力以及碳同化产物的分配。表达SBPase的转基因植物在植物源器官和库器官(sinkorgan)中的碳同化、碳输出和碳贮藏得到改善，从而导致作物生长、产量和品质改善。

                     发明背景

遗传工程学的最新进展已经提供了转化植物以使其包含外源(常常称为“异源的”或“异种的”)基因或改良的内源基因的必要工具。在植物中引入这样一个基因将有利地改善植物组织中已经存在的途径或是引入新途径，以改变所需产物的水平、增加代谢效率和/或节省细胞的能量消耗。目前有可能产生这样的植物：所述植物具有独特的、在农学和作物加工上高度重要的生理和生化性状和特征。对于作物改良，尤其有价值的目标是在植物生长和发育、作物产量潜力和稳定性、以及作物品质和组成方面起基本作用的性状。通过遗传修饰作物，获得碳同化的改善、更有效的碳贮藏、和/或碳输出和分配能力增加，可以达到这些改良。

植物、藻类和光合作用细菌的大气碳固定(光合作用)是在这样的生物中支持各种过程的主要能量源。在叶绿体基质中进行的卡尔文循环是高等植物中进行碳同化的主要途径。碳同化产物或者离开卡尔文循环进入蔗糖或淀粉的生物合成，或者继续进行所述循环以再生碳受体分子，即核酮糖-1，5-二磷酸。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶是一种催化分支区中一个基本不可逆反应的酶，在该分支区中中间产物可以离开所述循环，因此该酶可能对于调节在所述循环的再生阶段和蔗糖及淀粉生物合成之间的碳分配是至关重要的。

SBPase没有已知的胞质对应物，并且据报道仅在叶绿体中发现该酶，在叶绿体中该酶将景天庚酮糖-1，7-二磷酸(SBP)去磷酸化，生成景天庚酮糖-7-磷酸和无机磷酸。该酶对SBP具有特异性，并受到其产物和甘油酸(Schimkat等，1990)以及果糖-2，6-二磷酸(Cadet和Meunier，1988b)的抑制。光、还原剂和Mg2+是其活性所必需的(Woodrow，1982；Cadet和Meunier，1988a)。该酶是同源二聚体，其亚基分子量为35-38kDa(Nishizawa和Buchanan，1981；Cadet和Meunier，1988c)。

已经报道：使用反义技术在烟草植物中去除80％以上的SBPase酶活性，导致缺绿症、生长速度降低、以及碳同化水平降低(Harrison等，1998)。还观察到光合系统II的量子效率降低，这导致叶中的糖类含量降低。对糖类状态的分析显示：淀粉水平有变化，而蔗糖水平保持不变。这些结果指出SBPase是糖类代谢中可能的限速步骤。

已经在生化上表征了各种景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶，并且已经从下列生物中克隆了对应的mRNA(cDNA)：藻类(Genbank登记号：X74418；Hahn和Kuck，1994)和一些高等植物如普通小麦(Triticumaestivum)(Genbank登记号X65540；Miles等，1993)、菠菜(Spinaciaoleracea)(Genbank登记号L76556；Martin等，1996)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Genbank登记号S74719；Willingham等，1994)。因此，在转基因植物中过量表达编码SBPase的核酸序列将在所述植物中提供有利的结果，例如碳同化、输出和贮藏得到改善，光合作用能力增强，以及光合作用能力得到扩展。

                      发明简述

本发明提供了使用编码景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)的结构核酸构建体以改善植物中的碳同化的方法。

为达到上述目的，按照本发明的一个方面，提供了改善植物中碳同化的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)在植物的基因组中插入以5’到3’方向包含可操作性连接的下列元件的核酸序列：

(i)在选定植物组织的细胞中起作用的启动子，

(ii)导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列，

(iii)3’非翻译核酸序列，所述序列在植物细胞中起作用，导致转录终止并在RNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸；

(b)获得包含步骤(a)的核酸的转化植物细胞；和