[发明专利]在质粒序列转录过程中防止畸变RNA形成的方法和组合物

说明书

发明领域

本发明涉及通过降低多余多核苷酸序列表达，增强宿主细胞中多核苷酸序列表达效率的方法和多核苷酸组合物。更确切地说，本发明涉及通过应用这些组合物防止畸变DNA和RNA序列表达的新的组合物和方法。

发明背景

业已有文献指出，多核苷酸组合物可以用于医药，主要治疗或预防哺乳动物的疾病，以及用于这些领域的研究。确切地说，现在大量活动都围绕在应用多核苷酸组合物治疗细胞外和细胞内病原性感染，如病毒、细菌、真菌感染等。例如，有文献指出，DNA疫苗可以给哺乳动物细胞体内传递一种物质，该物质可以利用哺乳动物免疫系统对抗病原体。因此，这样的疫苗被设计成表达，例如表达蛋白或多肽，在接触感染物质刺激时，可以引起体液或细胞免疫应答。另一方面，基因治疗的载体也是多核苷酸组合物，通常设计用来给哺乳动物细胞传递一种蛋白质，所述蛋白质在哺乳动物中或者不表达、或者不正常表达、或者低表达。这些载体通常必然引起针对这些多核苷酸序列的种特异性免疫应答反应，所述多核苷酸序列被识别为抗原，并可引起多余细胞免疫应答。多核苷酸组合物的其他治疗应用是将缺失的或低表达的蛋白质导入患病哺乳动物患者。而且，多核苷酸本身可以作为有用的体内反应物，用于诊断/成像方法，作为反应物用于基因治疗、反义方法、疫苗应用，或者作为药物用于治疗或预防多种疾病，如遗传缺陷、感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病。多核苷酸还可作为体外反应物用于各种试验，如生物研究试验，医学、诊断、筛查和污染检测试验。

一系列本领域熟知的问题阻止了多种多核苷酸组合物成为广为接受的有用医药品。因此，至今被医药界接受用于治疗哺乳动物疾病的这种DNA疫苗或治疗剂还很少。

被称为转录后基因静默和转录静默的现象，业已在植物、线虫和果蝇中观察到。该现象提示，表达与调控元件具有某些同源性的多核苷酸序列的病毒、类病毒、质粒或RNA转染或感染植物、线虫或果蝇，可以导致内源性调控元件和/或基因以及外源性序列表达的永久抑制，所述调控元件如已在细胞中表达的启动子或自身基因或其一部分。这一静默效应业已显示是基因特异性的。见，例如，L.Timmons and A.Fire，Nature，395：354(Oct.29，1998)；A.Fire et al.，Nature，391：806-810(Feb.19，1998)；R.Jorgensen et al.，Science，279：1486-1487(March 6，1998)；J.R.Kennerdell and r.W.Carthew，Cell，95：1017-1026(Dec.1998)；L.Misquitta and B.M.Paterson，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，96：1451-1456(Feb.1999)；M.K.Montgomery et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，95：15501-15507(Dec.1998)]。编码全长前α1胶原基因的DNA质粒瞬时转染啮齿类动物成纤维组织细胞系后，观察到天然胶原基因的“静默”效应，以及基因的瞬时表达。[Bahramian and Zarbl，Mol.Cell.Biol.，19(1)：274-283(Jan.1999)]。

多核苷酸分子应用的另一个问题是形成畸变的RNA或DNA，而不是形成所需的包括基因的转录产物。业已假定，畸变RNA或DNA的形成发生在应用任何转染质粒或多核苷酸酸分子的情况下，降低靶基因表达的效率。畸变或异常RNA可能是上述静默效应的一个原因。

本领域众所周知，有很多可以通过商业渠道购买的序列具有终止转录的功能。例如，RNA聚合酶II的休止位点与转录终止有关，特别是当该位点位于瞬时表达系统中强poly A信号的直接下游时。[P.Enriquez-Harris et al，EMBO J.，9(7)：1833-1842(1991)；G.W.Hatfield etal，Mol.Cell.Biol.，3(10)：1687-1693(1983)]。

但是，直至今天，还没有建议，利用终止机制来创建一种有效的功能性组合物或方法，用于增加在医药、疫苗、基因治疗和诊断领域多核苷酸表达的效率。本领域确实存在这样一种需求，即应用相同的机制，利用多核苷酸组合物和方法，抑制畸变RNA或DNA分子的形成，增加宿主细胞中选定多核苷酸序列的表达。

发明简述