[发明专利]修饰化人源粒细胞－集落刺激因子及其制备方法

权利要求书

1.一种修饰化人源粒细胞—集落刺激因子(hG-CSF)，特征在于野生型hG-CSF(SEQ ID NO：2)的第1个，第2个，第3个和第17个氨基酸中至少一个被其它氨基酸替代。

2.权利要求1的修饰化hG-CSF，其氨基酸序列与野生型hG-CSF一样，除了

(a)第1个氨基酸为Ser(丝氨酸)；

(b)第1个氨基酸为Ser(丝氨酸)以及第17个氨基酸为X；

(c)第2个氨基酸为Met(蛋氨酸)以及第3个氨基酸为Val(缬氨酸)；

(d)第2个氨基酸为Met(蛋氨酸)，第3个氨基酸为Val(缬氨酸)以及第17个氨基酸为X；或者

(f)第17个氨基酸为X，

其中X是一个中性pH值时不带电荷的氨基酸。

3.权利要求2的修饰化hG-CSF，其中X是丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸或甘氨酸。

4.权利要求3的修饰化hG-CSF，其中X是丝氨酸。

5.一种编码权利要求1至4之一的修饰化hG-CSF的DNA。

6.权利要求5的DNA，其中修饰化hG-CSF DNA的第1个到60个核苷酸的序列相应于SEQ ID NOS：55，57，59，61，63，65，67和69中的一个。

7.一种包含权利要求5的DNA的表达载体。

8.权利要求7的表达载体，进一步包含在编码修饰化hG-CSF的DNA的5’端附加一个信号肽的多核苷酸。

9.权利要求8的表达载体，其中信号肽是大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽或修饰化大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽。

10.权利要求9的表达载体，其中大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：53。

11.权利要求9的表达载体，其中修饰化大肠杆菌抗热肠毒素II信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：54。

12.权利要求9的表达载体，进一步包含核苷酸序列为SEQ ID NO：71的修饰化大肠杆菌肠毒素II Shine-Dalgano序列。

13.权利要求8的表达载体，其中信号肽是大肠杆菌β内酰胺酶信号肽或修饰化大肠杆菌β内酰胺酶信号肽。

14.权利要求13的表达载体，其中大肠杆菌β内酰胺酶信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：24。

15.权利要求8的表达载体，其中信号肽是大肠杆菌基因III信号肽或修饰化大肠杆菌基因III信号肽。

16.权利要求15的表达载体，其中大肠杆菌基因III信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：42。

17.权利要求7或8的表达载体，它是pT14SS1SG，pT14SS1S17SEG，pTO1SG，pTO1S17SG，pTO17SG或pBAD2M3V17SG。

18.一种用权利要求7或8的表达载体转化的微生物。

19.权利要求18的微生物，它是转化的大肠杆菌。

20.权利要求19的微生物，其中转化的大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311，KCCM-10154)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO1SG(HM10409)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410，KCCM-10151)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411，KCCM-10152)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414)，大肠杆菌BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415)，大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510，KCCM-10153)，大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511)或大肠杆菌BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)。

21.一种在微生物中生产修饰化hG-CSF的方法，包括培养权利要求18中的转化微生物，从而生产和向周质分泌修饰化hG-CSF。