[发明专利]免疫原性降低的分子内交联的枯草杆菌蛋白酶

说明书

                     发明领域

本发明涉及改构的枯草杆菌蛋白酶，该蛋白酶被用于组合物，例如个人护理组合物、洗衣用组合物、坚硬表面清洁组合物和精细织品清洁组合物。

                     发明背景

酶构成最大一类天然蛋白质。其中的一类酶是能催化水解其它蛋白质的蛋白酶。通过将天然及基因工程蛋白酶掺加到清洁组合物中，尤其是与洗衣用有关的那些清洁组合物中已使得这种水解蛋白质的能力得以开发利用。

清洁领域中，最常用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。大多数丝氨酸蛋白酶是细菌生成的，而其中的一小部分是由其它微生物生成的，例如真菌。参见，Siezen，Roland J.等人“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟及蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4，No.7，719-737页(1991)。遗憾地是，野生型蛋白酶在其天然环境中的功效往往不能被优化用于非天然清洁组合物的环境中。具体地说，蛋白酶特性，例如，热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性以及底物特异性等，在该蛋白酶天然环境之外都未必能达到最佳使用状态。

现已用几种方法改变丝氨酸蛋白酶的野生型氨基酸序列，以增强该蛋白酶在非天然洗涤环境中的功效。这些方法包括蛋白酶的基因重构和/或化学修饰以增强蛋白酶在迥然不同条件下的热稳定性和氧化稳定性。

但是，由于这种修饰的蛋白酶对于哺乳动物是外源性的，所以它们是潜在的抗原。作为抗原，这些蛋白酶会引起哺乳动物的免疫原性和/或变应原应答(本发明中统称为免疫原性应答)。

另外，虽然在通过基因工程和化学修饰来开发用于洗衣的更高效蛋白酶的持续研究中已取得了显著的成效，但是这种蛋白酶还未商业化用于个人护理组合物和精细织品洗涤剂中。肥皂、凝胶、浴液以及香波等产品中不添加这些蛋白酶的主要原因是由于人体致敏会导致不良的免疫应答的问题。因此，提供一种具有蛋白酶的清洁性能但又不激发免疫应答的个人护理组合物或精细织品洗涤剂将具有十分重要的意义。

目前，通过固定化，造粒，包裹或溶解化学修饰的蛋白酶以避免蛋白酶进行空气传播可以将对蛋白酶的免疫原性应答降低到最低程度。这些方法虽然考虑了消费者与空气传播的蛋白酶接触，但仍存在着组织与最终组合物持久接触的危险。

也已提出通过将聚合物连接到蛋白酶上可以达到降低蛋白酶的免疫原性的目的。例如，参见，1979年12月18日颁布的授予Davis等的美国专利4179337；1999年1月5日颁布的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的美国专利5856451；1999年1月7日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 99/00489；1998年7月16日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 98/30682；和1998年8月13日公开的，Von Der Osten等的WO 98/35026。然而，这些提议并没有表明为了最有效地降低免疫原性应答而将聚合物连接到所述蛋白酶的特定氨基酸区域的重要性。

本发明人已经惊奇地发现通过对所述蛋白酶进行分子内交联能够降低所述蛋白酶的免疫原性。还发现这些分子内交联的蛋白酶仍然保持各自亲本蛋白酶的活性。另外，本发明人已发现了所述蛋白酶中最适合参加交联的特定残基，这是由于，例如，相对所述蛋白酶的表位区域(即，所述蛋白酶与免疫应答有关的位置)或切割位点(即，所述蛋白酶在体内发生水解的位置)的空间位置所致。

本发明人已发现了能激发减弱的免疫原性应答但仍保持其作为有效的和具有活性的蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶。因此，本发明的蛋白酶适于在几种类型的组合物中使用，该组合物包括但不限于，洗衣、清洁餐具、清洁坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洁接触透镜的组合物。

                     发明概述

本发明涉及具有分子内交联的枯草杆菌蛋白酶，其中分子内交联包括所述蛋白酶的第一个残基的氨基酸和所述蛋白酶的第二个残基的氨基酸之间的共价连接。

本发明的所述蛋白酶具有低于亲本蛋白酶的免疫原性。因此，这种蛋白酶适用于几种类型的组合物，该组合物包括但不限于，洗衣、清洁餐具、清洁坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洁接触透镜的组合物。

                    发明详述

本发明的必需组分如下所述。还包括对用于本发明实施方案中的各种任选及优选组分的非限制性描述。